生物炭對巖溶區黃龍病臍橙園土壤N2O排放的影響

岳鵬鵬, 付 燦, 江曉雨, 王 蓉, 黃雅丹

1)桂林醫學院智能醫學與生物技術學院, 廣西桂林 541199; 2)桂林醫學院研究生院, 廣西桂林 541199

溫室氣體排放增加導致全球氣候變暖, 引發嚴重環境問題(Field et al., 2014)。氧化亞氮(N2O)是引起升溫效應的主要溫室氣體之一, 其在大氣中存在壽命較長, 等摩爾濃度增溫潛勢強(Thomson et al.,2012; Fuertes-Mendizábal et al., 2019), 已引起越來越多的關注和減排研究(Shakoor et al., 2021; Shan et al., 2021)。

土壤是大氣N2O的主要排放源, 尤其是溫暖區農業土壤(Liu et al., 2016)。中國柑橘的種植面積居世界第一, 其種植過程中存在氮肥輸入量大、土壤酸化普遍(張影, 2014)和土壤 N2O排放量較大的特點。廣西是我國最重要的柑橘種植區之一, 也是全國巖溶面積分布最廣的地區之一。由碳酸鹽巖發育而來的巖溶土壤具有富鈣、粘重等特點, 進而其柑橘園土壤氮轉化相對于其他農業土壤具有一定的特殊性(楊會等, 2020)。黃龍病是柑橘生產中最具毀滅性的病害(Das et al., 2021), 患病植株可進一步影響根系土壤微生物群落結構, 進而擾動土壤N2O排放,增加溫室氣體排放風險。

N2O主要產生于土壤微生物介導的硝化和反硝化過程(Huang et al., 2014; Conthe et al., 2018), 是土壤氮循環的中間產物。土壤中硝化和反硝化微生物的活動直接影響N2O通量的源匯效應。生物炭是生物質在缺氧或無氧條件下熱解轉化而成的固體產物(Harter et al., 2014), 輸入土壤可同時實現降低土壤酸度、促進植物生長(Sheikhi et al., 2020)、增加碳封存等有益影響, 是目前在有效性和可持續性方面最受關注的土壤改良和減排措施。盡管已有研究證明生物炭輸入可降低土壤N2O的排放, 這主要歸因于生物炭對反硝化微生物的調節作用(Zhang et al., 2021)。但也有研究顯示生物炭可通過增加氨氧化細菌(AOB)等硝化相關微生物的豐度和加速總硝化率最終削弱其N2O減排效果甚至產生負效應(Sun et al., 2021)。不同土地利用類型和不同土壤健康狀況下生物炭添加對土壤 N2O排放的影響程度及其微生物調節途徑存在一定差異。生物炭作為土壤改良劑常用于黃龍病柑橘園土壤的改良, 但其對巖溶區黃龍病柑橘園土壤 N2O排放的影響及微生物調節途徑, 目前尚不清楚。

鑒于此, 本文擬以廣西巖溶區黃龍病臍橙園土壤為研究對象, 通過土壤培育等方法, 量化生物炭對該土壤N2O排放、氮素凈硝化率和礦化率、硝化和反硝化功能基因豐度的影響, 分析其相互關系并明確影響N2O排放主要因子。研究結果可為巖溶區黃龍病柑橘園土壤 N2O減排及調節機制研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 土壤采集與生物炭制備

供試土壤采集于廣西壯族自治區賀州市富川縣6年樹齡典型黃龍病紐荷爾臍橙園。富川縣位于廣西東北部, 屬亞熱帶季風氣候, 年均氣溫 19℃,年均降雨量1700 mm, 無霜期318 d, 是臍橙優勢產區。春季 3月份采集樣品, 在黃龍病臍橙樹株滴水線四個方向分別采集0-20 cm土壤并混勻。去除樹根和石頭后過2 mm土壤篩, 用于土壤培育和理化參數測定。其中, pH值測定采用電位法(土水比例為1:2.5)測定; 土壤 NH4+-N、-N通過連續流動分析儀(SEAL AA3, 德國)測定(委托廣西大學農學院測定); 土壤有機碳、總氮分別通過重鉻酸鉀氧化容量法和凱氏定氮法(FOSS KJELTEC 8420, 丹麥)測定(委托廣西大學農學院測定)。田間持水量通過環刀法測定。

生物炭購自河南弘之源凈水材料有限公司, 以玉米芯為原料在450°C無氧條件下熱解6 h制得。過 100目篩, 按照與土壤樣品相同的方法分析了生物炭的理化參數, 包括硝態氮、銨態氮、有機碳和總氮(表1)。

表1 土壤和生物炭的理化參數Table 1 Physical and chemical parameters of soil and biochar

1.2 土壤培育試驗

實驗室土壤培育設 5個生物添加處理, 其生物炭添加量分別為: 0(CK), 1%(B1), 2%(B2), 5%(B3),10%(B4)。各處理 3次重復、4次破壞性取樣, 共5×3×4=60個培養瓶(250 mL血清瓶)。稱取相當于25 g干土的土壤/土壤-生物炭混合物置于培養瓶中,根據土壤含水量和田間持水量(water capacity holding, WHC, 水/烘干土×100% =25.70%), 用去離子水調整培養土含水量為80%WHC。每瓶用帶6針孔封口膜封口靜置, 于 27℃生化培養箱中黑暗培養28 d, 培養過程中每2天稱重法補充水分。

在0 d, 1 d, 2 d, 4 d, 7 d, 14 d, 21 d和28 d通過培養瓶頂部 N2O的濃度變化來測定 N2O排放量。每次取樣前去掉培養瓶封口膜通風 1 h, 用丁基膠塞密封后立即用帶三通閥的注射器抽氣15 mL取得第一個氣體樣品, 4 h后采集第二個氣體樣品。使用氣相色譜儀(Agilent7890B, 美國)測定樣品中 N2O的濃度。N2O 排放速率計算公式為:E=P×V×(Δc/Δt)×(1/RT)×M×(1/m), 其中E表示 N2O排放速率(ug·kg-1·h-1),P表示標準大氣壓(pa),V表示培養瓶頂部空間的體積(V=培養瓶體積V瓶－培養土體積V土, cm3),c表示N2O的濃度(×10-6),t是兩次采樣之間的時間(h), R表示通用氣體常數, T表示絕對空氣溫度(K),M是的N2O的分子量(g·mol-1),m是土壤質量(干重)(kg)(Hu et al., 2017; Deng et al.,2019)。兩次測定間隔內 N2O排放量為兩次平均排放速率與時間(h)的乘積, N2O累積排放量為不同時間段氣體排放量的總和(ug·kg-1)(崔靜雅等, 2017)。

在0 d, 7 d, 14 d, 28 d破壞性取土樣置于-80℃保存, 用于測定土壤銨態氮、硝態氮, 硝化、反硝化功能基因拷貝數。氮素凈硝化和氮礦化率用下列公式計算(Li et al., 2017): NNR=(Nf-N0)/T, NMR=(Nf+Af-N0-A0)/T, 其中, NNR, NMR分別為土壤培育時間內土壤氮素的凈硝化率和凈礦化率(mg·kg-1·d-1),Nf和N0分別代表培養結束和初始時含量(mg·kg-1),Af和A0分別代表培養結束和初始時含量(mg·kg-1),T表示培養的天數(d)。土壤DNA通過DNeasy?Power Soil?土壤DNA提取試劑盒(QIAGEN, 美國)提取。功能基因(包括AOA-amoA, AOB-amoA,nirK,nosZ)拷貝數通過實時熒光定量PCR測得(BIO-RAD CFX96, 美國)。各功能基因擴增引物情況如表2, 最后通過每克干土中所含功能基因的拷貝數表示功能基因豐度。

1.3 統計分析

土壤 N2O排放和土壤理化參數通過 Microsoft Office Excel 2007軟件統計分析。差異顯著性性分析通過SPSS21.0軟件LSD方差分析進行。土壤N2O排放速率(三個重復)與各土壤因子(包括含量和各功能基因豐度)的關系通過除趨勢對應分析(Detrended Correspondence Analysis, DCA)進行研究(PCORD 5.0)。

表2 功能基因qPCR擴增引物Table 2 Primers used for qPCR amplification of functional genes

2 結果與分析

2.1 生物炭對土壤 N2O排放速率和累積排放量的影響

添加生物炭可降低土壤 N2O平均排放速率和累積排放量(圖1), 但各處理間無顯著差異。平均降低幅度和添加生物炭的量有關, 當生物炭添加量為5%時, N2O平均排放速率和累積排放量降幅最大分別達到14.39%和37.04%。

圖1 生物炭對土壤N2O排放速率(A)和累積排放量(B)的影響(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理; 圖中不同字母代表差異顯著(P＜0.05))Fig. 1 The effects of adding biochar on soil N2O emission rates (A) and cumulative emissions (B) (CK, B1, B2, B3, and B4 represent different biochar addition treatments; different letters represent significant differences (P＜0.05))

2.2 生物炭對土壤氮素凈硝化率和礦化率的影響

生物炭添加對土壤氮素平均凈硝化率和礦化率均產生了影響(圖2)。隨著生物炭添加量的增加,土壤氮素凈硝化率先增加后降低, 在生物炭添加量為2%(B2)時提高了196.64%, 但在生物炭添加量≧5%(B3、B4)時, 硝化率反而降低。另一方面, 添加生物炭后土壤氮素礦化率顯著提高, 由 CK的負值變為正值, 且在生物炭添加量為 5%時礦化率提高達到峰值, 不同處理間存在極顯著差異。

圖2 生物炭對土壤凈氮硝化率和礦化率的影響(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理, 圖中不同小寫字母代表差異顯著(P＜0.05), 不同大寫字母代表差異極顯著(P＜0.01))Fig. 2 The effects of adding biochar on soil net nitrogen nitrification rates and mineralization rates (CK, B1, B2, B3,and B4 represent different biochar addition treatments,different lowercase letters represent significant differences(P＜0.05), and different capital letters represent extremely significant differences (P＜0.01))

2.3 生物炭對功能基因拷貝數的影響

實時熒光定量 PCR結果顯示(圖3), 巖溶區黃龍病臍橙園酸性土壤硝化(AOA-amoA和AOB-amoA)和反硝化相關功能基因(nosZ和nirK)豐度均隨生物炭添加量增加先增加后降低, 在添加量為 2%時(B2)達到峰值。其中, 氨氧化古菌AOA-amoA基因的拷貝數(3.72×1011±0.69×1011)顯著高于氨氧化細菌 AOB-amoA基因(3.38×109±0.98×109) (P＜0.01), 且后期降幅相對較小, 在B2、B3、B4中均維持較高拷貝數(三個處理間無顯著差異)。反硝化最后一步限速功能基因nosZ拷貝數((4.28±0.82)×1011g-1干燥土壤)顯著高于另一反硝化相關基因nirK((5.55±1.14)×1010g-1干燥土壤)(P＜0.01)。nosZ拷貝數在B1、B2中顯著高于CK,nirK拷貝數B4中低于CK且在各處理間無顯著差異。

圖3 生物炭對功能基因AOA-amoA(A), AOB-amoA(B), nosZ(C), nirK(D)拷貝數的影響(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理; 圖中不同字母代表差異顯著(P＜0.05))Fig. 3 Effects of biochar on the copy numbers of functional genes, including AOA-amoA(A), AOB-amoA(B), nosZ(C), and nirK(D)(CK, B1, B2, B3, and B4 represent different biochar addition treatments; different letters represent significant differences (P＜0.05))

2.4 生物炭添加不同處理土壤 N2O排放速率與土壤因子排序

不同處理的 N2O平均排放速率和土壤因子變量的DCA排序結果較直觀的展示了N2O排放和各因子的關系(圖4)。其中,、nirK拷貝數以及nosZ拷貝數與N2O排放速率負相關, AOA-amoA拷貝數、與土壤N2O排放速率正相關。CK與B1排放速率相似, 生物炭添加量增加后, B2、B3和B4的N2O排放速率特征在排序第一軸和第二軸均顯示了一定差異, 在第一軸主要受的影響, 在排序第二軸主要受nosZ拷貝數的影響。然而, AOA-amoB拷貝數在排序第一軸和第二軸均未表現出明顯的排列規律。

圖4 生物炭添加不同處理土壤N2O排放速率與土壤因子DCA排序圖(CK、B1、B2、B3、B4分別代表不同的生物炭添加處理, NH4+-N、-N分別代表土壤中NH4+-N、-N的質量分數, AOA-amoA, nirK, nosZ代表分別代表AOA-amoA, nirK, nosZ基因拷貝數)Fig. 4 DCA ordination diagram of soil N2O emission rates and soil factors with different treatments of biochar addition (CK, B1, B2, B3, and B4 represent different biochar addition treatments, NH4+-N、-N represent the mass fractions of NH4+-N and -N in the soil, and AOA-amoA, nirK, and nosZ represent the number of copies of AOA-amoA, nirK, and nosZ genes, respectively)

3 討論

本研究中, 生物炭添加改變了土壤氮素凈硝化率/礦化率、反硝化相關功能基因nosZ和硝化相關功能基因 AOA-amoA、AOB-amoA的豐度, 且添加量為 2%時是多數指標增長的峰值, 與對照差異顯著, 提示 2%生物炭添加量是其調節土壤氮轉化的活躍點。

AOA和AOB驅動的氨氧化作用是硝化作用的限速步驟, 在土壤 N2O產生中起重要作用(Caranto et al., 2016)。本研究發現生物炭添加增加了AOA-amoA和AOB-amoA基因拷貝數, 這與有些研究中生物炭添加會增加硝化功能基因豐度、加速總硝化率最終削弱其N2O減排效果(Sun et al., 2021)的結果基本一致。值得注意的是隨著生物炭添加量的增加, AOB-amoA拷貝數先增加后降低, 與土壤氮素凈硝化率變化一致。而AOA-amoA拷貝數無顯著降低, 對N2O排放速率影響更顯著, 顯示出本研究條件下AOA對生物炭添加的敏感性。

本研究中, 添加生物炭降低了巖溶區臍橙園土壤N2O平均排放速率和累積排放量, 但各處理間無顯著差異, 可能與生物炭對反硝化和硝化相關功能基因的雙向刺激有關。AOA-amoA和nosZ、nirK基因豐度反向作用于土N2O排放速率, 最終形成本文中添加生物炭后 N2O排放速率和累計排放量的差異狀態。今后若要進一步提高生物炭對巖溶區黃龍病柑橘園土壤N2O減排的效應, 可以考慮通過添加硝化抑制劑等手段降低生物炭對硝化菌或硝化途徑的刺激作用。

4 結論

(1)生物炭添加顯著改變了土壤氮素凈硝化率/礦化率, 反硝化相關功能基因nosZ和硝化相關功能基因 AOA-amoA、AOB-amoA的豐度, 且生物炭添加量為2%時是多數指標增長的峰值。

(2)添加生物炭降低了巖溶區臍橙園土壤 N2O的平均排放速率和累積排放量, 但各處理間差異不顯著。這與生物炭添加對硝化相關功能基因AOA-amoA(增加N2O排放)的激發作用有關。

(3)生物炭添加不同處理 N2O的排放速率主要受含量、nirK豐度、nosZ豐度的負向影響,含量和AOA-amoA豐度的正向影響。若要進一步提升生物炭對該土壤的減排效果, 應注意提升土壤水平和反硝化相關功能基因豐度, 抑制土壤水平和硝化相關功能基因 AOA-amoA的豐度。

致謝:本文樣品采集工作得到桂林醫學院李劍橋同志的大力支持和幫助, 特此致謝！

Acknowledgements:

This study was supported by the Guangxi Youth Science Foundation Project (No. 2018JJB150056), and the Guangxi Science and Technology Base and Talent Special Project (No. 2020AC20045).