基于指紋圖譜與多成分定量結合化學模式識別技術的彝族藥紫地榆質量評價研究

田宇柔，郗仲玟，馮玉，姜曉婭，牛麗穎

1.河北中醫學院，河北 石家莊 050091；2.河北省中藥配方顆粒技術創新中心，河北 石家莊 050091；3.中藥材品質評價與標準化河北省工程研究中心，河北 石家莊 050091；4.河北省高校中藥配方顆粒應用技術研究中心，河北 石家莊 050091

紫地榆，又名赤地榆、隔山消，為牻牛兒苗科紫地榆Knuth的干燥根，始載于《滇南本草》，為云南省特有民族藥，收載于2005年版《云南省中藥飲片標準（第一冊）》，其味苦、酸、澀，性微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡功效。現代研究發現紫地榆主要含有鞣質、酚酸類、黃酮類等化學成分，具有抗炎鎮痛、止血、防齲、抗氧化等藥理作用。現行地方標準對其炮制、性狀等鑒定部分進行了相關規定，但缺乏化學成分質量分析控制，且現有文獻對紫地榆質量研究不足，僅對部分化學成分進行含量測定，難以對不同產地藥材的差異性進行全面評價。

近年來，指紋圖譜與多成分定量分析相結合的中藥質量控制模式廣泛用于中藥材質量評價，化學模式識別技術在基源鑒別、炮制研究、真偽鑒定、產地分析等方面發揮著重要作用，常用方法包括聚類分析、主成分分析、判別分析、偏最小二乘判別分析（PLSDA）等。在進行中藥指紋圖譜的建立與多成分定量的同時，結合化學模式識別技術對數據圖譜信息進行分析處理，能夠更加科學客觀地對中藥質量進行分析評價與控制。因此，本研究建立彝族藥紫地榆HPLC指紋圖譜，同時對6種指標性成分進行含量測定，通過SIMCA14.1軟件進行化學模式識別，以期對不同產地的紫地榆藥材進行質量評價，為其質量控制提供參考依據。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；CPA225D型電子天平、BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

對照品沒食子酸（批號110831-201605，純度90.8%）、鞣花酸（批號111959-201903，純度88.8%），中國食品藥品檢定研究院；兒茶素（批號PS020094）、短葉蘇木酚酸（批號PS21054-10）、五沒食子酰基葡萄糖（批號PS020247），純度均為98.0%，成都普思生物科技股份有限公司；柯里拉京（批號111623-200302），中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純），Fisher化學試劑公司，其他試劑均為分析純，水為超純水。

15批紫地榆藥材由神威藥業集團有限公司提供，經楚雄彝族自治州中醫醫院副主任醫師余惠祥鑒定為牻牛兒科紫地榆Knuth的干燥根，來源信息見表1。

表1 15批紫地榆樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液

精密稱取沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖對照品適量，加甲醇溶解，制成一定濃度的對照品貯備液；精密吸取上述各對照品貯備液適量，加甲醇稀釋，即得濃度為沒食子酸48.40 μg/mL、兒茶素135.00 μg/mL、短葉蘇木酚酸14.60 μg/mL、柯里拉京128.40 μg/mL、鞣花酸65.20 μg/mL、五沒食子酰基葡萄糖140.90 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取紫地榆藥材粉末（過40目篩）約0.2 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Thermo Syncronis C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%A；5～18 min，10%～12%A；18～35 min，12%～13%A；35～37 min，13%A；37～47 min，13%～15%A；47～57 min，15%～16%A；57～67 min，16%～18%A；67～71 min，18%A；71～75 min，18%～20%A；75～80 min，20%A；80～85 min，20%～80%A；85～88 min，0%～5%A；88～95 min，5%A），流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長270nm，進樣量10μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取同一批樣品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。以鞣花酸（19號峰）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積，結果顯示各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗

取同一批樣品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別于制備后0、5、10、14、20、24 h進樣分析，記錄色譜圖。以鞣花酸（19號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗

取同一批樣品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以鞣花酸（19號峰）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評價

2.4.1 共有峰標定取15批紫地榆藥材，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件下測定，得15批樣品HPLC色譜圖。將所得色譜圖導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版），S1號色譜圖作為參照圖譜，以中位數法生成對照圖譜，多點校正進行峰匹配，生成疊加圖譜（見圖1）和對照圖譜（見圖2），將分離度較好且為主要成分的色譜峰作為共有峰，最終標定21個共有峰。其中19號峰的分離度較好且出峰時間穩定，故設為參照峰（S）。

圖1 15批紫地榆樣品HPLC指紋圖譜

圖2 紫地榆HPLC對照圖譜

2.4.2 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）計算相似度，15批樣品圖譜與對照圖譜相似度分別 為0.974、0.982、0.990、0.975、0.989、0.989、0.951、0.908、0.911、0.984、0.984、0.980、0.984、0.985、0.984，均大于0.9，表明不同產地不同批次間紫地榆藥材差異性較小，具有良好的一致性。但由于不同產地環境等因素的影響，化學質量仍存在一定差異。

采用對照品對色譜峰進行指認，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，得到對照品HPLC色譜圖（見圖3）。最終指認6個特征峰，即2、5、7、10、19、21號峰分別為沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖。

圖3 紫地榆中6種成分混合對照品溶液HPLC圖

2.5 化學成分含量測定

2.5.1 線性關系考察

精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液2、4、8、10、12、16、20 μL，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以進樣量為橫色標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程及線性范圍（見表2），結果表明6種化學成分在線性范圍內呈良好的線性關系。

表2 6種成分線性關系考察結果

2.5.2 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖的峰面積RSD 分別為0.49%、0.48%、0.44%、0.49%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗

取同一批樣品（S3）粉末0.2 g，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別在0、5、10、14、20、24 h進樣，測定峰面積，沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖的峰面積RSD 分別為0.29%、2.93%、2.95%、1.67%、1.13%、0.60%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

從公式看出所以在氣體質量流量Gg和霧化氣流流速Vg中，提高霧化氣流流速Vg對氣體動能增加效果明顯。從能量守恒定律可推出，氣體的動能增加，相應轉化為增大總表面積的表面能。但是這種能量交換過程效率極低，不到1%。

2.5.4 重復性試驗

取同一批樣品（S3）粉末0.2 g，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，計算沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖的峰面積RSD分別為0.37%、0.49%、1.06%、2.04%、2.51%、2.93%，表明方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（S3）粉末9 份，每份約0.1 g，精密稱定，按各成分含量的50%、100%、150%精密加入已知濃度的對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備并按“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖平均加樣回收率分別為98.70 %、102.72%、101.31%、102.10%、102.65%、100.12%，RSD分別為1.90%、1.78%、1.50%、1.65%、1.81%、0.54%，表明該方法準確良好。

2.5.6 含量測定

取15批紫地榆藥材粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行2份，按“2.2”項下色譜條件測定，計算樣品中沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖含量，結果見表3。

表3 15批紫地榆中6種化學成分含量測定結果（mg/g）

2.6 化學模式識別

2.6.1 主成分分析

為進一步探究不同產地批次間紫地榆藥材的質量差異性，將15批樣品中沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖的含量作為變量導入SIMCA14.1軟件進行主成分分析，得分圖見圖4。提取特征值＞1的2個成分作為主成分1、主成分2，累計貢獻率達89.62%（見表4），說明這2個主成分可反映紫地榆藥材的整體綜合質量。

表4 主成分特征值及方差貢獻率

圖4 15批紫地榆PCA得分

主成分載荷矩陣可反映各變量對主成分的貢獻大小和作用方向，根據因子載荷矩陣（見表5），主成分1與沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、鞣花酸的含量均呈正相關，主成分2與兒茶素、短葉蘇木酚酸和五沒食子酰基葡萄糖的含量呈正相關。根據各主成分值及貢獻率計算綜合得分（F），F＝0.514 3F1＋0.381 9F2結果見表6。綜合得分排序可反映不同批次紫地榆藥材質量，排名越高質量越好。可以看出，S12～S14質量相對較優。

表5 因子載荷矩陣

表6 主成分值及綜合主成分值

2.6.2 聚類分析

在SIMCA14.1軟件中以6種活性成分的含量為變量，進行系統聚類，結果見圖5。類間距離為30時，15批藥材可聚為三類：Ⅰ類S1～S6（產地楚雄雙柏、楚雄姚安）、Ⅱ類S7～S9（產地麗江寧蒗）、Ⅲ類S10～S15（產地麗江華坪、香格里拉維西）。該結果與主成分分析結果一致。表明同一產地不同批次藥材間具有較強相似性，不同產地間則差異較大，分析可能與地理位置、氣候等相關。

圖5 15批紫地榆聚類分析樹狀圖

2.6.3 偏最小二乘判別分析

在主成分分析、聚類分析基礎上，將6種成分含量作為變量導入SIMCA14.1軟件進行PLS-DA建模分析，結果見圖6。PLS-DA 模型累計解釋模型參數RX、RY 分別為0.994、0.753，預測能力參數Q為0.511，均大于0.5，表明該模型預測能力較好，可用于不同產地紫地榆的區分分析。

圖6 15批紫地榆PLS-DA得分

變量重要性投影（VIP）可衡量各共有峰的表達模式對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，對于輔助篩選質量差異標志物有較大貢獻。本研究在95%置信區間內優先選擇VIP＞1.0的成分作為造成不同批次間質量差異的標志性化合物，分別為鞣花酸（VIP＝1.20）、兒茶素（VIP＝1.14）、五沒食子酰基葡萄糖（VIP＝1.03）、柯里拉京（VIP＝1.00），這些成分可能是造成不同產區紫地榆質量差異的重要因素，結果詳見圖7。

圖7 紫地榆樣品中6種指標成分VIP

3 討論

紫地榆所含化學成分復雜，本試驗將供試品溶液在190～400 nm進行全波長掃描，比較不同波長的色譜峰數目、峰面積及分離度，發現在270 nm波長處各色譜峰峰形較好，分離度高，特征性強。本試驗考察了不同流動相系統（乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%磷酸）及比例，結果顯示以乙腈-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，所得各色譜峰峰形較好，分離度高。本試驗以指標成分含量為考察指標，對提取溶劑（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇）、提取體積（15、25、50 mL）和超聲時間（15、30、45 min）進行單因素考察，發現以70%甲醇25 mL為溶媒超聲處理30 min時各成分提取率最高。本試驗對確定的色譜條件進行了耐用性研究（不同溫度、波長、流速、色譜柱），結果均符合要求，表明此方法簡便準確，可為紫地榆的質量控制及評價提供參考。

中藥化學成分具有多樣性與復雜性的特點，且各成分之間具有相互協同作用。多成分的復雜性決定了單一成分指標評價難以表達中藥的質量，并由此提出多成分質量控制的模式，應用最為廣泛有兩類，一類是反映中藥化學成分整體模糊信息的指紋圖譜方法，另一類是多指標成分同時測定。本研究采用HPLC對15批紫地榆藥材進行指紋圖譜研究，結果顯示15批樣品具有良好的相似性，但由于不同產地環境等因素的影響，化學質量仍存在一定差異，故選擇沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖6種指標成分進行含量測定，所選擇的6種成分均有一定的藥理活性作用。沒食子酸、兒茶素、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖均為紫地榆中鞣質類化合物，鞣質為紫地榆的有效化學成分，具有抗氧化、防齲、抗菌、抗病毒作用，其中沒食子酸、兒茶素和鞣花酸具有較強的抑菌活性，可對致齲菌產生生長抑制、加快衰亡、降低黏附、破壞細胞膜、改變通透性、破壞生物膜完整，以及降低乳酸脫氫酶、蔗糖酶活性的作用。短葉蘇木酚酸為酚酸類化合物，羅廷順等在優化紫地榆多酚提取工藝的基礎上，考察其體外抗氧化活性，發現紫地榆多酚清除DPPH和ABTS的能力良好，尤其對ABTS清除能力最優并呈現出良好的量效關系。含量測定結果顯示，5種鞣質類指標成分含量均大于短葉蘇木酚酸，短葉蘇木酚酸含量較低且不同產地樣品間各成分含量存在較大差異。

為進一步考察不同產地藥材差異，采用主成分分析、聚類分析及PLS-DA方法對紫地榆進行綜合質量評價，結果顯示S12～S14產地的紫地榆藥材質量較優，結合含量測定結果發現，較優產地藥材其6種活性成分含量也較高。通過VIP排序，篩選得到影響紫地榆藥材質量的4種標志性成分，分別為鞣花酸、兒茶素、五沒食子酰基葡萄糖、柯里拉京。本研究所建立的HPLC指紋圖譜及多成分含量測定方法穩定可靠，結合化學模式識別技術可更加全面綜合地對紫地榆藥材質量進行評價。但由于紫地榆中所發現的化學成分較少，是否存在影響其質量的其他成分尚待確認。后續研究將運用多種分析技術對紫地榆進行全面的化學成分分析，補充化學成分信息庫，以期建立更加科學可靠的質量評價標準。