眼病外泌體生物學(xué)標(biāo)志物的研究進(jìn)展

梁高華　鐘敬祥

[專家介紹]鐘敬祥，教授，主任醫(yī)師，眼科學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，博士后聯(lián)合培養(yǎng)導(dǎo)師。現(xiàn)為暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院副院長，暨南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院常務(wù)副院長。長期從事干細(xì)胞治療、基因治療在眼科的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究、白內(nèi)障及角膜相關(guān)研究。現(xiàn)任亞洲干眼協(xié)會中國分會委員、廣東省醫(yī)學(xué)會眼視光與近視防控學(xué)分會主任委員、廣東省醫(yī)師學(xué)會眼科分會副主任委員;廣東省中西醫(yī)眼科學(xué)會副主任委員;亞太區(qū)屈光手術(shù)協(xié)會委員;衛(wèi)生部眼內(nèi)鏡評審委員會委員;廣東省眼科學(xué)會委員;廣東省防盲學(xué)會常委;廣東省眼耳鼻喉創(chuàng)傷學(xué)會委員;廣東省醫(yī)師協(xié)會理事。在國內(nèi)外期刊共發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇（包括SCI）。先后承擔(dān)國家自然科學(xué)基金項目、國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目、國家科技支撐計劃項目及廣東省自然科學(xué)基金項目等多項科研課題。先后榮獲2015年羊城好醫(yī)生、2016年廣東醫(yī)院優(yōu)秀管理干部、2017年嶺南名醫(yī)、2017年暨南大學(xué)學(xué)位與研究生教育先進(jìn)個人等稱號。《中華現(xiàn)代眼科雜志》常務(wù)編委、《眼科新進(jìn)展》編委、《廣東醫(yī)學(xué)》特邀審稿委員。

【摘要】外泌體是細(xì)胞外囊泡的一個子集，直徑為40～160 nm（平均100 nm）的生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)（如mRNA、microRNA和DNA）、脂質(zhì)、糖和細(xì)胞環(huán)境相關(guān)的結(jié)合物，存在于細(xì)胞外液如血液、腦脊液、唾液、淚液、眼房水等體液中，可介導(dǎo)細(xì)胞通訊、細(xì)胞分化、細(xì)胞廢物管理、免疫調(diào)節(jié)和新血管形成等多種生物功能。隨著外泌體研究的深入及個性化治療的迅猛發(fā)展，將外泌體研究擴展到眼部疾病迅速成為研究的焦點。

【關(guān)鍵詞】外泌體;眼病;生物學(xué)標(biāo)志物

中圖分類號：R771文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.06.001

Research progress of the exosomes as biomarkers for eye diseases

LIANG Gaohua ZHONG Jingxiang

（1. Department of Ophthalmology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;

2. Department of Ophthalmology， First Affiliated Hospital of Jinan University， Guangzhou 510630， Guangdong， China）

【Abstract】? Exosome， as a subset of extracellular vesicles， is a kind of bioactive molecules with diameters of 40 to 160 nm （average 100 nm）， containing proteins， genetic materials （such as mRNA， microRNA and DNA）， lipids， sugar， and cell environment-related conjugates. It exists in extracellular fluids such as blood， cerebrospinal fluid， saliva， tears， and aqueous humor， etc.， and can mediate a variety of biological functions such as cell communication， cell differentiation， cell waste management， immunoregulation， and neovascularization， etc. With the deepening of exosome research and the rapid development of individualized treatment， the extension of exosome research to eye diseases has rapidly become the focus of research.

【Key words】exosomes; eye diseases; biomarkers

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一個子集，直徑為40～160 nm（平均100 nm）的生物活性分子，包括蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)[如mRNA、microRNA（miRNA）和DNA]、脂質(zhì)、糖和細(xì)胞環(huán)境相關(guān)的結(jié)合物，存在于細(xì)胞外液如血液、腦脊液、唾液、淚液、眼房水等體液中，可介導(dǎo)細(xì)胞通訊、細(xì)胞分化、細(xì)胞廢物管理、免疫調(diào)節(jié)和新血管形成等多種生物功能。隨著外泌體研究的深入及個性化治療的迅猛發(fā)展，將外泌體研究擴展到眼部疾病迅速成了研究的焦點。本文主要對眼病的外泌體生物學(xué)標(biāo)志物的研究進(jìn)展，以及未來研究領(lǐng)域進(jìn)行綜述。

1外泌體概述及其生物學(xué)特征

外泌體是在細(xì)胞外分泌，從細(xì)菌到人類的整個進(jìn)化過程中都存在[1]，是具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)特征及與細(xì)胞具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的膜結(jié)合體（雙膜囊泡）。到目前為止，共鑒定出與外泌體相關(guān)的9769個蛋白質(zhì)、3408個mRNAs、2838個miRNAs和1116個脂質(zhì)（http：//www.exocarta.org/），進(jìn)行細(xì)胞交換、免疫調(diào)節(jié)、生物分子轉(zhuǎn)運和生理調(diào)節(jié)等胞內(nèi)外信息交換作用[2～3]。外泌體中的生物分子成分因其來源細(xì)胞的類型和生理狀態(tài)不同而表現(xiàn)出不同生物功能，這使它們成為一種有吸引力的生物標(biāo)志物，可以為我們提供一種動態(tài)方法來提高對疾病病理生物學(xué)的理解、預(yù)測疾病進(jìn)展和免疫反應(yīng)治療。

1.1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是外泌體最基本、最重要的生物學(xué)功能。早期研究報告稱，外泌體可能是以細(xì)胞垃圾載體來排出細(xì)胞中的代謝廢物[4]。外泌體可以實現(xiàn)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)各種生理和病理過程，還可以將信息傳輸?shù)蕉鄠€單元和位置，而不需要自分泌、旁分泌和細(xì)胞間直接接觸的經(jīng)典途徑。外泌體還可以通過內(nèi)吞作用將其貨物轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，從而改變細(xì)胞狀態(tài)并產(chǎn)生功能效應(yīng)[5]。外泌體的攝取能力取決于受體細(xì)胞的類型而不是供體細(xì)胞的類型，這可能與器官特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。因而，需要進(jìn)一步研究來了解外泌體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定細(xì)胞和分子基礎(chǔ)。

1.2免疫調(diào)節(jié)功能外泌體在免疫學(xué)中的作用已被廣泛研究。B淋巴細(xì)胞衍生的外泌體通過主要組織相容性復(fù)合物（MHC）蛋白（MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ）執(zhí)行抗原呈遞[7]。癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞一樣，可以產(chǎn)生免疫活性外泌體，影響免疫調(diào)節(jié)機制。雖然外泌體免疫調(diào)節(jié)作用的研究主要集中在癌癥疾病上，但近年來也研究了外泌體在眼部疾病中的免疫調(diào)節(jié)潛力[8]。需要更進(jìn)一步研究外泌體在免疫介導(dǎo)的眼病中的作用。

1.3修復(fù)再生功能外泌體包含著特定成分在各種疾病模型中修復(fù)和再生發(fā)揮重要作用。干細(xì)胞來源的外泌體能夠?qū)⑻囟ǔ煞郑╩RNA、miRNA和蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞或損傷部位來誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)損傷后修復(fù)[9]。此外，來自間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的外泌體通過促進(jìn)遷移和增殖、增強基質(zhì)合成、減少細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來參與損傷的修復(fù)和再生[10]。同樣，外泌體促進(jìn)再生的能力已在眼病模型中得到驗證。RPE細(xì)胞內(nèi)經(jīng)受氧化應(yīng)激的外泌體顯示VEGFR-1和VEGFR-2的表達(dá)增加以及增強在內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成能力[1]。數(shù)據(jù)表明，外泌體可能是MSCs的一個令人信服的替代品，將有助于避免使用鮮活MSCs-based治療所涉及的大多數(shù)問題[11]。

1.4作為生物學(xué)標(biāo)志物外泌體具有作為多種疾病的生物標(biāo)志物的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，在健康個體和患有各種疾病的患者之間，外泌體的數(shù)量和外泌體中的特定生物活性物質(zhì)存在顯著差異[12]。 外泌體也存在于與眼部密切相關(guān)的體液中，如房水（AH）[13]和玻璃體液（VH）[14]。外泌體的定向蛋白質(zhì)組可以揭示RPE單層的極性特異性功能[15]。來自年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）、息肉狀脈絡(luò)膜血管病變（PCV）和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞（CRVO）相關(guān)研究顯示，所有這些患者AH中的特異性蛋白升高，提示AH中的外泌體蛋白可作為AMD診斷的生物標(biāo)志物[16]。此外，AMD的主要病變部位RPE細(xì)胞的基底側(cè)可釋放外泌體也是診斷視網(wǎng)膜疾病的潛在生物標(biāo)志物[17]。同樣，作為眼科疾病診斷的特異性標(biāo)志物的外泌體及其RNA有效載體的潛力在最近引起了人們的廣泛關(guān)注。AH含有特征性的外泌體RNA，這可能為開發(fā)用于疾病診斷的外泌體提供重要的基礎(chǔ)信息[18]。

誠然，外泌體由于其結(jié)構(gòu)組成、多樣化的生物學(xué)功能和獨特的生物學(xué)來源而帶來了廣泛的研究及應(yīng)用領(lǐng)域，且外泌體在健康個體及疾患個體上均有不同表達(dá)，估計在信號轉(zhuǎn)換、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)、抗炎、藥物載體、氧化應(yīng)激中顯示了其獨特的生物標(biāo)志物作用，因此，越來越多的研究焦點集中在外泌體的治療作用，眼球是一個極其敏感的器官，隨著外泌體在眼病研究中的深入，外泌體在前后節(jié)眼病的作用機制是一個值得關(guān)注的問題。

2眼部疾病的外泌體生物學(xué)標(biāo)志物

近年來，利用外泌體和其他EVs識別疾病生物標(biāo)志物的興趣呈指數(shù)級增長，很容易理解為什么基于外泌體的診斷分析的開發(fā)潛力如此巨大。外泌體憑其獨有的特征，成為尋找新生物標(biāo)志物的理想靶點：（1）脂質(zhì)雙層保護(hù)外泌體內(nèi)的RNA、DNA和蛋白質(zhì)免受細(xì)胞外環(huán)境中的核酸酶和蛋白酶的影響;（2）外泌體包含組織、細(xì)胞或疾病特異性蛋白質(zhì)和核酸;（3）外泌體的相對耐寒性可以使用多種方法從一系列體液（即血漿、血清、尿液、唾液、淚液、房水和腦脊液）中分離和富集。外泌體生物標(biāo)志物在癌癥、心血管疾病和糖尿病研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景[19～21]促進(jìn)了眼部疾病外泌體生物學(xué)標(biāo)志物的研究。

2.1淚液從理論上講，淚液中眼病外泌體生物標(biāo)志物的鑒定和表征具有很大的潛力。特別吸引人的是收集淚液的無創(chuàng)性質(zhì)，但一個潛在的缺點是可以收集的體積相對較小。迄今為止，淚液作為外泌體生物標(biāo)志物的來源尚未得到廣泛研究，我們在Pubmed搜索發(fā)現(xiàn)關(guān)于研究淚液中外泌體標(biāo)志物的文獻(xiàn)甚少。淚液的蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物研究已經(jīng)確定了許多蛋白質(zhì)（如膜聯(lián)蛋白和熱休克蛋白）與外泌體相關(guān)，盡管并未就此進(jìn)行深入研究[22～23]，但隨著外泌體分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定方法和核酸測序的最新進(jìn)展，淚液源性外泌體生物標(biāo)志物的診斷和治療潛力將是一個廣泛開放的研究領(lǐng)域。

2.2房水AH已被用于各種眼病的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)生物標(biāo)志物分析[24～26]。一些最常見的眼部疾病，例如青光眼[27～28]、AMD[29～30]、糖尿病相關(guān)眼病[31～32]和葡萄膜炎[33～34]等研究了AH中的生物標(biāo)志物含量。盡管絕大多數(shù)核酸和脂質(zhì)生物標(biāo)志物，以及在AH中鑒定的一些蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物很可能與外泌體相關(guān)，但很少有人關(guān)注外泌體特異性生物標(biāo)志物。已有研究將EVs從AH中分離出來。例如，DISMUKE等首先證明外泌體是AH中主要的EVs類型，并含有特征性外泌體RNA，這可能為開發(fā)用于疾病診斷的外泌體提供重要的生物標(biāo)志物[35]。外泌體的定向蛋白質(zhì)組可顯示RPE單層的極性特異性功能[15]。有實驗室進(jìn)行了幾項研究，重點關(guān)注AH中的外泌體及其在青光眼中的潛在作用，其中一項專門針對生成可用于識別外泌體生物標(biāo)志物的數(shù)據(jù)[35]。最后，目前尚不清楚從RPE、Müller細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或其他視網(wǎng)膜細(xì)胞釋放的外泌體或其他小型EVs是否可以進(jìn)入AH。為了幫助回答這個問題并可能識別新的AH外泌體生物標(biāo)志物，需要對這些細(xì)胞類型在體外釋放的外泌體的組成進(jìn)行基本表征。有正在進(jìn)行的研究旨在仔細(xì)表征從RPE釋放的外泌體和其他EVs[15]，可用作識別和驗證AH中潛在外泌體生物標(biāo)志物的資源。總之，未來關(guān)注AH眼病的外泌體生物標(biāo)志物的研究必須利用適當(dāng)?shù)耐饷隗w特異性方法進(jìn)行分離;并且非常需要表征來自幾種不同視網(wǎng)膜細(xì)胞類型的外泌體的蛋白質(zhì)和核酸組成。

2.3玻璃體液在玻璃體手術(shù)、常規(guī)抗VEGF和抗PDGF注射可以獲取VH，而不會讓患者感到更多不適。因此，如果可以識別和驗證強大的玻璃體外泌體生物標(biāo)志物，那么它們的實際用途可能是巨大的。VH很有可能包含諸如AMD、萎縮型視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼和許多其他視網(wǎng)膜病變等疾病的特異生物標(biāo)志物。在蛋白質(zhì)組學(xué)、核酸和脂質(zhì)組學(xué)方法的研究確定了視網(wǎng)膜靜脈阻塞[36]、AMD[37]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[38]和原發(fā)性開角型青光眼[39]中發(fā)現(xiàn)有趣的潛在玻璃體生物標(biāo)志物。然而，這些研究都沒有探索或討論外泌體在VH中生物標(biāo)志物的運輸和存在中的作用。在這些研究中發(fā)現(xiàn)的一些生物標(biāo)志物，例如AMD中的PED[40]和糖尿病視網(wǎng)膜病變中的角蛋白-1及PEDF[41]是與外泌體相關(guān)的蛋白質(zhì)。外泌體特異性方法識別相關(guān)生物標(biāo)志物的前景部分在于可以實現(xiàn)的特異性，而不是引用研究中使用的全局方法。對玻璃體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，其中包含與外泌體相關(guān)的蛋白質(zhì)和非外泌體相關(guān)蛋白質(zhì)的混合物，有可能掩蓋任一部分疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的相關(guān)性。因此，通過專門分離EVs可以去除可溶性（非外泌體/EVs相關(guān)的）蛋白質(zhì)，并避免潛在的混淆結(jié)果。在迄今為止的幾項研究中可以看到這種潛力顯示，將玻璃體內(nèi)的EVs作為疾病生物標(biāo)志物的來源[14，29，42]。

2.4血液血液成分，如血漿和血清，可能是在眼病中識別外泌體生物標(biāo)志物的最有前途的體液。這在很大程度上是由于：（1）標(biāo)本收集比AH和VH更容易且侵入性更小;（2）可以收集更大的體積。使用血液作為眼外泌體來源的一個缺點可能是，這些外泌體可能只占全身循環(huán)中外泌體總量的一小部分，因此難以檢測和分析。為了從血液中成功識別和分離眼部外泌體或小型EVs，對在健康和病理條件下從眼細(xì)胞釋放的外泌體進(jìn)行基本描述性表征是必不可少的。一旦確定了眼部細(xì)胞特異性的外泌體相關(guān)標(biāo)志物，它們就可用于將眼外泌體與血液中存在的大量非眼EVs中分離出來。如果沒有針對眼外泌體的富集步驟，開發(fā)基于血液的眼病生物標(biāo)志物的任務(wù)可能是站不住腳的。目前，有基于免疫親和性的商業(yè)試劑盒可用于直接從人血漿和血清中分離外泌體（Diagenode、MBL International和System Biosciences），支持這種方法的可行性。然而，在許多情況下，如果樣本來自人類以外的其他物種（因為大多數(shù)商業(yè)試劑盒僅針對人類樣本開發(fā)），或者如果不是商業(yè)提供的目標(biāo)，則在許多情況下仍然需要開發(fā)和驗證內(nèi)部免疫親和方法套件的重要性。最近，一種被稱為“液體活檢”的新的診斷概念出現(xiàn)了，預(yù)示著腫瘤微創(chuàng)基因特征的巨大潛力。目前研究支持血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、miRNA和外泌體作為葡萄膜黑色素瘤（UM）的生物標(biāo)志物的可能性證據(jù)[43～44]。特別是這些生物標(biāo)志物有在UM患者管理過程中幫助臨床決策的潛力。該研究代表了一個令人鼓舞的概念驗證，用于識別體循環(huán)中眼病特異性生物學(xué)標(biāo)志物。

3小結(jié)與展望

雖然我們對外泌體在癌癥中及其他領(lǐng)域中的作用已經(jīng)了解很多，但外泌體在許多眼部特殊組織中的功能才剛剛開始進(jìn)行嚴(yán)格的研究。多項研究為外泌體在眼病的病理過程中發(fā)揮重要作用提供了證據(jù)，包括炎癥、神經(jīng)元變性、氧化應(yīng)激和新生血管形成。此外，外泌體具有跨越生物屏障的能力，可作為生物標(biāo)志物或治療載體，可能為眼病患者帶來新的希望。然而，基于外泌體的復(fù)雜性和多樣性，外泌體在眼科疾病中的功能和機制還需要進(jìn)一步研究，尤其是其作為生物標(biāo)志物或治療載體方面的研究。因此，在眼科疾病中發(fā)展眼部體液源性外泌體生物標(biāo)志物及治療方案需要大量的研究，擁有廣闊的研究及應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)[1] LI S F，HAN Y，WANG F，et al.Progress in exosomes and their potential use in ocular diseases[J].Int J Ophthalmol，2020，13（9）：1493-1498.

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