茯苓多糖調節2型糖尿病模型大鼠肝臟糖異生的機制研究

韓思婕 潘翔 朱芊芊 張丹丹 張涵瑞 方敬賢 魏瓊 劉丹 葉曉川

關鍵詞茯苓多糖;2 型糖尿病;氧化應激;PI3K/Akt/FoxO1通路;糖異生

2 型糖尿病占糖尿病發病例數的90%以上，由2 型糖尿病導致的并發癥大多與患者的高病死率有關[1-2]。目前，臨床上用于治療糖尿病的雙胍類藥物具有明顯的副作用[3]。而中藥在治病救人方面有幾千年的歷史，更是在防治2 型糖尿病及其并發癥方面具有多靶點、多途徑、個體化等不可替代的優勢，因此，尋找標本兼治、副作用小、療效穩定的中藥及其有效成分治療糖尿病是國內外研究的重點。

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心的功效[4]。糖尿病屬中醫“消渴癥”范疇，而茯苓是中醫治療消渴癥的高頻用藥[5]。茯苓多糖為茯苓菌核中的主要成分，占菌核質量的70%～80%[6]，具有抗腫瘤、抗炎、保肝、調節免疫等多種藥理作用[7]。有研究報道，茯苓多糖能通過調節腸道菌群來改善肥胖小鼠的糖脂代謝，減輕肝臟脂肪變性[8]。多項研究表明，茯苓多糖可以減輕糖尿病腎病小鼠的腎損傷[9-11]。在生理條件下，機體血糖水平通過體內葡萄糖產生和攝取間的動態平衡來維持穩定。糖異生是將一些非糖前體，如乳酸、甘油、生糖氨基酸等轉變為葡萄糖的過程，肝臟糖異生是導致內源性葡萄糖生成增加的重要原因，而2 型糖尿病患者中糖異生作用異常活躍[12]。目前已有研究證明，抑制肝臟糖異生是治療2型糖尿病的有效策略[13]。另有研究證實，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/叉頭框轉錄因子O1（forkheadbox transcription factor O1，FoxO1）信號通路可調節肝臟糖異生[14]。本研究主要探討茯苓多糖是否可以通過調節PI3K/Akt/FoxO1 通路，抑制糖異生關鍵酶——磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6- 磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）的蛋白表達，進而調節2 型糖尿病模型大鼠血糖，以期為闡明茯苓多糖發揮降血糖的作用機制提供數據支持。

1 材料

1.1 儀器

LiDE110 型凝膠成像儀購自日本Canon 公司;Spark10M型酶標儀購自瑞士Tecan 公司;Centrifuge 5810R型高速離心機購自德國Eppendorf 公司;530 活力型手持血糖儀購自江蘇魚躍醫療設備股份有限公司;WTM-1812D型膜分離實驗設備、ST-2B-1812 型微濾膜元件、V0.2-2B-1812 型超濾膜元件均購自杭州沃騰膜工程有限公司;FD-1A-50 型冷凍干燥機購自北京博醫康實驗儀器有限公司;Eclipse E100 型光學顯微鏡、DS-U3 型成像系統均購自日本Nikon公司。

1.2 藥材與試劑

茯苓藥材采自湖北省英山縣石頭咀鎮，經湖北中醫藥大學藥學院葉曉川教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核。鹽酸二甲雙胍片（批號ABU7707，規格0.5 g/片）購自中美上海施貴寶制藥有限公司;鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號301V021，規格1 g）購自北京索萊寶科技有限公司;三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肝糖原試劑盒（批號分別為20210423、20210426、20210422、20210420、20210425、20210426、20210420）均購自南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅（HE）染液套裝、RIPA 裂解液（批號分別為G1003、CR2103126）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;TBST緩沖液（批號21128946）購自合肥白鯊生物科技有限公司;兔抗磷酸化PI3K（p-PI3K）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號分別為ab182651、ab181602）均購自英國Abcam 公司;兔抗磷酸化Akt（p-Akt）、兔抗磷酸化FoxO1（p-FoxO1）（批號分別為#4060、#9461）均購自美國CST 公司;兔抗G6Pase（批號LS-C446262）購自美國LSBio 公司;兔抗PEPCK（批號14892-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（批號AS1107）購自南非Aspen 公司;磷酸和氫氧化鈉均為食品級;水為純水。

1.3 動物

SPF 級SD 大鼠購自湖北省醫學實驗動物中心，動物許可證號為SCXK（鄂）2020-0018，動物合格證號為42000600040888。動物實驗經湖北中醫藥大學倫理委員會批準，批準號為HUCMS202103009。大鼠飼養于（20±2）℃、相對濕度50%～70%、12 h 明暗交替環境中，自由飲水、攝食，適應性喂養5 d 后用于實驗。

2 方法

2.1 茯苓多糖的制備

茯苓丁粉碎后經80%乙醇回流提取2 次（提取時間分別為2、1 h），濾過，取濾渣，揮干至無醇味后用氫氧化鈉溶解，常溫下充分攪拌后過濾。濾液用磷酸調至pH=7，沉淀用純水洗滌數次，濾過后的洗滌液經WTM-1812D型膜分離實驗設備微濾、超濾后，與上述沉淀合并，冷凍干燥后得茯苓多糖。采用苯酚-硫酸法測得茯苓多糖含量為95.60%。

2.2 分組、造模與給藥

大鼠適應性喂養5 d 后，禁食4 h（每次禁食均換墊料以避免墊料內遺漏有飼料，影響禁食效果），取大鼠尾尖靜脈血，用530 活力型手持血糖儀檢測空腹血糖，作為大鼠基礎血糖值。將大鼠按照禁食4 h 后基礎血糖水平組間差異無統計學意義（P>0.05）為標準，分為空白對照組、模型組、二甲雙胍組（陽性對照，劑量為200mg/kg）和茯苓多糖低、中、高劑量組（劑量分別為100、200、400 mg/kg），每組8 只，各給藥組的劑量依據來自前期預實驗。除空白對照組外，其余各組大鼠采用高脂飼料聯合STZ 誘導構建2 型糖尿病大鼠模型：大鼠飼喂高脂飼料，第21 天時禁食不禁水12 h，根據預實驗結果腹腔注射STZ 40 mg/kg;3 d 后檢測造模大鼠空腹血糖值均大于11.3 mmol/L，表明造模成功;繼續飼喂高脂飼料至第28 天，鞏固造模。造模同時，模型組和空白對照組大鼠每日灌胃等體積水，各給藥組大鼠每日灌胃相應劑量的藥物，每日1 次，連續灌胃42 d。

2.3 日常狀態觀察及體質量檢測

實驗期間觀察大鼠的飲水量、尿量、飲食量、毛色、精神狀態等情況，并每日測定大鼠的體質量。

2.4 空腹血糖檢測和口服葡萄糖耐量試驗

各組大鼠在給藥前、給藥后（給藥結束前1 d）檢測空腹血糖。口服葡萄糖耐量試驗：給藥前1 d 禁食4 h 后取大鼠尾尖靜脈血，用530 活力型手持血糖儀檢測灌胃葡萄糖前（0 h）的血糖;然后灌胃2.5 g/kg 葡萄糖，分別在灌胃0.5、2 h 時檢測血糖，計算口服葡萄糖耐量試驗曲線下面積（area under curve，AUC）：AUC=0.25×（血糖0 h+4×血糖0.5 h+3×血糖2 h）。AUC越大說明2 型糖尿病模型大鼠對葡萄糖的代謝能力越弱，側面反映糖尿病的病程。

2.5 臟器指數計算

末次給藥后，取大鼠腹部主動脈血，再解剖得大鼠心臟、肝臟、腎臟組織，用生理鹽水清洗、濾紙擦拭、稱定質量后，置于-80 ℃冰箱保存。臟器指數=臟器質量/體質量×1 000。

2.6 HbA1c、TG、TC、MDA、GSH-Px、SOD水平及肝糖原含量檢測

取“2.5”項下血樣和肝臟組織。用肝素抗凝管取全血2～4 mL，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，留沉淀的紅細胞，再用生理鹽水按上述方法洗滌2～3 次，得壓積紅細胞。取壓積紅細胞1 mL，加冷雙蒸水1.5 mL，用漩渦混勻器充分混勻1 min 制得溶血液，置于-20 ℃冰箱保存，用于檢測HbA1c 水平。用普通采血管取全血5mL，以3 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清液即為血清，置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測血脂指標TG、TC水平和抗氧化指標MDA、GSH-Px、SOD 水平。取肝臟組織約100 mg檢測肝糖原含量。各指標檢測操作均嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

2.7 肝臟和胰腺組織病理學觀察

隨機選擇“2.5”項下每組3 只大鼠的肝臟和胰腺組織，用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色、二甲苯透明后，于光學顯微鏡下觀察肝細胞情況和胰島細胞變性壞死情況，并用顯微鏡照相系統拍照（每個樣品隨機選取3 個區域），進行病理學等級評分。其中肝臟病理等級評分采用Knodell 組織學活動指數評分系統并參考文獻[15]：Ⅰ級為界面性炎癥及橋接壞死的程度，按0～4 分評定;Ⅱ級為小葉內肝細胞變性和壞死的范圍及匯管區的炎癥狀況，按0～4 分評定;Ⅲ級為纖維化程度，按0～4 分評定。胰腺病理等級評分標準參考文獻[16]：Ⅰ級為胰島形態損壞的程度，按0～4分評定;Ⅱ級為胰島細胞排列紊亂及細胞核游離的程度，按0～4 分評定;Ⅲ級為胰島細胞數量減少及細胞壞死的程度，按0～4 分評定。以上評分越接近0 分代表病理程度越輕，越接近4分代表病理程度越重。

2.8 肝臟組織PI3K/Akt/FoxO1 通路相關蛋白表達水平檢測

采用Western blot 法檢測。取“2.5”項下部分凍存肝臟組織，加RIPA裂解液，冰浴徹底勻漿，將勻漿液轉移至離心管中，振蕩，冰浴30 min，同時用移液器反復吹打，確保勻漿液完全裂解。以12 000 r/min 于4 ℃離心5min，收集上清液，即為總蛋白溶液。取部分總蛋白溶液用BCA試劑盒測定總蛋白含量，剩余部分沸水浴5 min使蛋白變性，變性后置于-80 ℃冰箱保存，備用。取變性蛋白40 μg，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，其中分離膠電壓80 V，濃縮膠電壓120 V;用0.45 μm的PVDF膜300 mA轉膜90 min，用牛奶封閉1 h，分別加入p-PI3K、p-AKT、p-FoxO1、PEPCK、G6Pase 和GAPDH一抗（稀釋度分別為1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶500、1 ∶2 000、1 ∶10 000），于4 ℃孵育過夜;次日，用TBST 漂洗3 次，加入相應二抗（稀釋度為1 ∶10 000），于常溫下繼續孵育1 h 后，用TBST漂洗3 次，滴加新鮮配制的ECL混合溶液（魯米諾與過氧化氫體積比1 ∶1 混合）至膜的蛋白面，暗室中曝光，根據不同的光強度調整曝光條件，顯影、定影。將膠片進行掃描存檔，采用AlphaEase? FC 軟件處理系統導出目的蛋白和內參GAPDH的灰度值，采用Excel 軟件計算，以目的蛋白條帶與內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.9 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統計學處理。計量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠日常狀態和體質量的影響

實驗期間，大鼠均有較強的行動力。空白對照組大鼠皮毛健康有光澤，實驗前后飲食量幾乎無變化。模型組大鼠表現狂躁，出現多飲、多食、多尿癥狀，毛色不華，部分呈淺黃褐色并伴有掉毛現象，體質量較空白對照組顯著減輕（P<0.05）。給予相應劑量藥物后，二甲雙胍組大鼠多飲、多食、多尿、毛色不華等狀態改善，但體質量與空白對照組比較仍顯著減輕（P<0.05），并伴有便溏現象。與模型組比較，茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠狂躁狀態改善，多飲、多食、多尿、毛色不華等現象得到緩解，體質量回升，其中茯苓多糖中劑量組分別與模型組、二甲雙胍組比較，以及茯苓多糖高劑量組與二甲雙胍組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。

3.2 茯苓多糖對2型糖尿病模型大鼠臟器指數的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟、腎臟臟器指數均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠腎臟臟器指數和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟（除茯苓多糖低劑量組外）、腎臟臟器指數均顯著降低（P<0.05）。結果見表1。

3.3 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠口服葡萄糖耐量的影響

灌胃葡萄糖溶液0～0.5 h 期間，各組大鼠的血糖水平均呈逐漸增加的趨勢;而在灌胃0.5～2 h 期間，其血糖水平又均呈逐漸降低的趨勢。與空白對照組比較，模型組大鼠在灌胃葡萄糖溶液0、0.5、2 h 時的血糖水平和AUC均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低（除0 h 時外）、中、高劑量組大鼠在灌胃葡萄糖溶液0、0.5、2 h 時的血糖水平和AUC均顯著降低（P<0.05）。結果見表2。

3.4 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠空腹血糖和HbA1c的影響

給藥前，各組大鼠空腹血糖水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。給藥后（給藥結束前1 d），與空白對照組比較，模型組大鼠空腹血糖、HbA1c 水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖水平，以及二甲雙胍組和茯苓多糖中劑量組大鼠HbA1c 水平均顯著降低（P<0.05）。結果見表3。

3.5 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠血脂水平、抗氧化水平及肝糖原含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、MDA水平和肝糖原含量顯著升高，GSH-Px、SOD 水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠TC、TG、MDA水平和肝糖原含量均顯著降低，SOD水平顯著升高（P<0.05）;茯苓多糖中劑量組大鼠GSH-Px 水平顯著升高（P<0.05）。結果見表4。

3.6 肝臟和胰腺組織病理學觀察結果

大鼠肝臟組織HE染色結果見圖1。由圖1 所示，空白對照組大鼠肝小葉形狀規則，肝細胞形態正常，肝索排列整齊、呈放射狀分布。模型組大鼠肝小葉不明顯，肝細胞排列散亂，肝索結構消失，肝竇擴大，細胞間呈不同程度的皺縮，導致空泡較多，可見淋巴細胞浸潤。二甲雙胍組大鼠肝索明顯，但中央靜脈周圍有巨噬細胞，表明肝細胞有炎癥。茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝索和肝竇結構較模型組有所恢復，細胞皺縮情況均有所改善。各組大鼠肝臟病理等級評分見表5。由表5可知，與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟病理等級評分均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟病理等級評分均顯著降低（P<0.05）。

大鼠胰腺組織HE染色結果見圖2。由圖2 所示，空白對照組大鼠胰島形態結構完整、呈橢圓形，細胞排列整齊、孔隙較小，細胞核大小相差不大。模型組大鼠胰島形態被破壞、變形呈葫蘆狀，中央可見空亮區和許多空泡，細胞核大小不一且游離于細胞邊緣。二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠胰島形態、細胞核情況較模型組均有所改善。各組大鼠胰腺病理等級評分見表6。由表6 可知，與空白對照組比較，模型組大鼠胰腺病理等級評分均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠胰腺病理等級評分均顯著降低（P<0.05）。

3.7 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠肝臟組織中PI3K/Akt/FoxO1 通路相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1 蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），PEPCK、G6Pase蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1（除茯苓多糖低劑量組外）蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），PEPCK、G6Pase蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。結果見圖3、圖4。

4 討論

本研究采用高脂飼料聯合STZ構建了2 型糖尿病大鼠模型，所得模型大鼠常伴有血脂異常、體質量減輕，且伴有HbA1c 水平持續升高等癥狀，與以往文獻一致[17]。

體質量下降被認為是糖尿病的典型特征，這與葡萄糖代謝缺陷和組織蛋白過度分解有關，而HbA1c 常作為糖尿病控制的監測指標[18]。在糖尿病的發生過程中，高血糖、高胰島素血癥和游離脂肪酸升高均可誘導活性氧產生，而強氧化環境可能會導致胰島素抵抗等生理功能障礙和糖尿病并發癥發生[19]。本研究結果顯示，茯苓多糖給藥后，能夠恢復大鼠體質量，顯著降低2 型糖尿病模型大鼠的空腹血糖、HbA1c 水平，改善葡萄糖耐受情況，減輕氧化應激水平。此外，茯苓多糖還可降低2 型糖尿病模型大鼠血清中的TC、TG 水平，遏制糖尿病病程中因糖脂代謝異常導致的膽固醇代謝異常，減輕胰腺組織的結構破壞，從而發揮保護胰島β細胞的作用。

肝臟在能量平衡中起著至關重要的作用，而糖尿病病程發展中容易引起肝臟相關并發癥發生，嚴重者甚至導致死亡[20]。因此，肝臟損傷程度和肝糖原含量間接反映了機體的胰島素活性和糖代謝能力[21]。本研究中，模型組大鼠肝糖原含量顯著升高，肝臟病理切片顯示肝細胞形態改變，肝小葉不明顯，肝細胞排列散亂，肝索結構消失，肝竇擴大，表明2 型糖尿病模型大鼠的肝臟損傷可能與糖脂代謝失調及長期高糖刺激引起的炎癥損傷有關。茯苓多糖給藥后，各劑量組大鼠的肝糖原含量顯著降低，肝臟組織病理學檢查顯示肝索和肝竇結構得到改善，表明茯苓多糖可以改善2 型糖尿病模型大鼠的肝臟損傷情況，也間接反映了茯苓多糖可以改善胰島素活性和糖代謝能力。

PI3K信號分子調節葡萄糖的攝取和代謝，其下游的關鍵節點Akt 磷酸化后可以調節糖異生和糖原合成[22]。FoxO1 是位于PI3K/Akt 途徑下游的關鍵因子，其轉錄活性受磷酸化的Akt 調節，而肝臟FoxO1 功能增強會導致胰島素作用受損及肝臟糖異常增多;相反，糖尿病發展過程中會損壞PI3K/Akt 通路，負調控使FoxO1 去磷酸化相對激活并移位到細胞核，去磷酸化的FoxO1 活性增強，從而增加糖異生[23]。本研究結果顯示，與模型組比較，茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1 蛋白表達水平均顯著升高，表明茯苓多糖可以激活2 型糖尿病模型大鼠肝臟PI3K/Akt/FoxO1通路。

正常生理情況下，肝臟通過葡萄糖和糖原的互相轉化來維持空腹血糖的正常水平。而2 型糖尿病患者的空腹高血糖主要是由肝臟糖異生所導致的[24]。PEPCK 和G6Pase 是肝臟糖異生過程中2 種關鍵的限速酶，可通過抑制這2 種酶來干預肝臟糖異生[25]。FoxO1 是肝臟糖異生關鍵酶調控的上游靶點，被磷酸化的FoxO1 能夠抑制G6Pase 和PEPCK 的蛋白表達，從而抑制糖異生[26]。本研究結果顯示，與模型組比較，茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠PEPCK 和G6Pase 蛋白表達水平均顯著降低，表明茯苓多糖可以抑制肝臟糖異生。

綜上所述，茯苓多糖可以通過減弱氧化應激，上調PI3K/Akt/FoxO1 通路，從而下調糖異生關鍵酶PEPCK和G6Pase的蛋白表達，發揮抑制肝臟糖異生的作用，進而有效降低2型糖尿病模型大鼠的血糖水平，調節糖脂代謝。