D5S818基因座等位基因丟失對親子鑒定結果的影響

蘭菲菲 陳延冰 何天文 梁杰

廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心（廣州 511442）

短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）是人類基因組DNA 中的一類具有長度多態性的DNA 序列，片段長度一般在500 bp 以內，符合孟德爾遺傳定律，被廣泛應用于親權鑒定檢測中。受不同人群基因多態性及引物結合位點突變等因素的影響，親權鑒定檢測實踐中會遇到STR 位點發生的一些特殊現象，例如突變、off-ladder、等位基因丟失、稀有等位基因等等［1］。STR 基因座的基因分型特點，有研究人員采用不同的檢測體系，在不同人群中進行了分析［2-5］。基因多態性也是較為常見的引起STR 基因座發生特殊基因分型的原因之一，不僅對STR 擴增結果有一定影響，同時也與一些疾病的發病相關［6-7］。由于STR 基因座的等位基因丟失對于親子鑒定結果有不同程度的影響，及時發現并運用正確的分析檢測方法是十分必要的。

D5S818 基因座位于人類5 號染色體5q23.2 區域，是由AGAT 組成的四核苷酸核心重復序列，等位基因分型范圍在7～18 波動。D5S818 基因座是1997年美國聯邦調查局建立的聯合DNA 索引系統（Combined DNA Index System，CODIS）的13 個STR 基因座之一［8］，是司法部司法鑒定科學研究院能力驗證親權鑒定項目考核內容的19 個常染色體必檢STR 基因座。在親子鑒定的實際檢測應用中，筆者發現利用PowerPlex21 系統檢測STR 基因座分型時會出現個別基因座的等位基因丟失現象。該現象對親子鑒定結果分析有一定的影響，從而干擾親子關系的鑒定結論，本文詳細報道了D5S818 基因座等位基因丟失現象的分析及避免其對鑒定結論影響的方法。對PowerPlex21 系統D5S818 基因座的等位基因丟失情況進行了總結與驗證，提出該系統在中國南方漢族人群中D5S818基因座檢測位點的局限性。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用樣本為本院司法鑒定所2017-2019年受理的換發出生醫學證明、入戶等司法用途親子鑒定案例的積累。與委托人簽署知情同意書后，采集受檢者外周靜脈血2 mL 或者毛囊等生物檢材用于實驗檢測及分析。用于親權鑒定商業化的一些檢測系統中包含有D5S818 基因座（表1），本研究的樣本檢測采用PowerPlex21 系統。在對3 248 例家系親子鑒定的結果分析中發現，5 個家庭的7 名個體在D5S818 基因座出現了等位基因12 的丟失。

表1 包含D5S818 基因座的8 種STR 分型商業化檢測系統Tab.1 Eight commercial STR genotyping systems with D5S818 locus

1.2 主要試劑與儀器 試劑：PowerPlex21 復合擴增體系（美國Promega 公司），AmpFLSTR Identifiler復合擴增體系（美國AB 公司）。儀器：2720 型PCR擴增儀（美國AB 公司），3500XL 基因分析儀（美國AB 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 STR基因座的等位基因分型 用Chelex-100（濃度為5%）法，樣本經過洗滌、離心收集沉淀細胞、Chelex-100 孵育后煮沸，提取DNA 待用。DNA樣本按照PowerPlex21 復合擴增體系的說明書，復合擴增21 個STR 基因座。PCR 擴增的反應體系為10 μL：Buffer Mix 2 μL，Primer Set 2 μL，ddH2O 6 μL，DNA 1 μL。PCR 擴增條件：96 ℃1 min；94 ℃10 s，59 ℃1 min，72 ℃30 s，30 個循環；60 ℃10 min。擴增產物用3500XL 基因分析儀電泳，用GeneMapper ID-X Vertion1.3（美國AB 公司）自動分析STR 基因座的基因型。

1.3.2 D5S818 基因座等位基因丟失的驗證 發生等位基因丟失的7 名個體及其家系，用Chelex-100法重新提取樣本的DNA，根據Identifiler 復合擴增體系的說明書，復合擴增16個STR基因座。PCR擴增的反應體系為25 μL：PCR Reaction Mix 10.5 μL，Primer Set 5.5 μL，DNA Polymerase 0.5 μL，DNA 10 μL。PCR 擴增條件：95 ℃11 min；94 ℃1 min，59 ℃1 min，72 ℃1 min，28 個循環；60 ℃60 min。擴增后的產物電泳與分析與1.3.1 內容相同，選擇Identifiler 體系的分析方法和內標。

1.3.3 累積親權指數（CPI）計算 根據GeneMapper ID-X Vertion1.3 分析的STR 基因座等位基因分型，使用鑒定所自主研發的親權指數計算軟件、按照司法部頒布的《親權鑒定技術規范》［9］中的計算方法，分別計算每個STR 基因座的父權指數（PI）和每個家庭的累積親權指數。PowerPlex21 與Identifiler 體系分別進行計算，根據CPI 的計算結果得出鑒定結論。

2 結果

2.1 D5S818 基因座可能存在等位基因丟失 在3 248 案例中使用PowerPlex21 體系檢測分析時發現，有5 個家系的分析結果中D5S818 基因座提示母親發生“突變”，電泳圖顯示為“純合”而峰高與雜合等位基因的峰高相似，分析D5S818 基因座可能存在等位基因丟失的情況，5 個家系D5S818 基因座的電泳圖譜見圖1。

圖1 D5S818 基因座等位基因分型圖譜（PowerPlex21 體系）Fig.1 Genotyping map of D5S818 loci（PowerPlex21 system）

2.2 Identifiler 體系驗證D5S818 基因座等位基因12 的丟失 可能發生等位基因丟失的5 個家系樣本重新提取DNA，采用Identifiler 體系進行PCR復合擴增后發現，其中7 名個體能夠檢測分析出D5S818 基因座的等位基因12（圖2），說明這7 名個體在使用PowerPlex21 體系擴增時發生了等位基因12 的丟失（表2）。

表2 D5S818 基因座的分型及等位基因丟失情況分析Tab.2 Genotyping of D5S818 locus and analysis of allelic loss

圖2 D5S818 基因座等位基因分型圖譜（Identifiler 體系）Fig.2 Genotyping map of D5S818 loci（Identifiler system）

2.3 D5S818基因座等位基因丟失對CPI的影響使用PowerPlex21 體系檢測分析出現的等位基因丟失家系，屬于單個基因座的不符合遺傳規律情況，易被誤認為“突變”進行CPI 的計算。本文中的5 家系根據PowerPlex21 和Identifiler 的STR 基因座等位基因分型結果計算CPI，由于PowerPlex21體系出現“突變”，分別計算父子與母子的二聯體CPI 以確認是否存在父子或者母子關系，見表3。

表3 D5S818 基因座等位基因丟失家系的CPI 計算Tab.3 CPI calculation of D5S818 allele loss families

3 討論

親權鑒定檢測中存在STR 基因座的等位基因丟失現象［10］，其發生的原因有幾種可能性，例如不同人群STR 基因座的多態性或者個體DNA 在STR基因座的核心序列內發生了突變［4，11］，以及在檢測體系的引物擴增結合區發生了突變的情況［12-14］，都會使等位基因擴增失敗而發生假丟失。使用不同的商業化檢測體系均有報道STR 基因座等位基因丟失的情形，例如用Goldeneye 20A 與PowerPlex Fusion 體系檢測在D2S1338 基因座發現丟失等位基因19［15］、Microreader21 ID 體系中發生了D18S51基因座的等位基因19 丟失［13］、D18S51 基因座使用GoldenEye 20A 體系檢測出現了等位基因18，19 的丟失［16］、PowerPlex21檢測體系中D8S1179基因座丟失等位基因13［17］。Penta E 基因座在Microreader21 ID 與Goldeneye 20A 體系均出現過丟失等位基因11［18］。隨著檢測人群數量的增加，STR 基因座多態性的影響效應也逐漸呈現得較為明顯［19-22］，而不同的檢測體系在同一基因座的分型范圍及等位基因的頻率分布差異也并不相同。因此，明確不同體系檢測方法STR 基因座等位基因丟失情況及其對鑒定結果影響，在親子鑒定實踐中具有重要參考價值。

本文發現在中國南方漢族人群中利用該體系檢測時，D5S818 基因座的等位基因12 容易發生丟失。根據研究報道顯示，使用華夏白金檢測系統調查D5S818 基因座的等位基因分型范圍為7-15［23］，PowerPlex21 系統中D5S818 基因座的等位基因分型范圍為6-18，AmpFLSTR Identifiler 系統分型范 圍 為7-16，PowerPlex21 系統中D5S818 等 位基因的檢測分型范圍略廣泛，在該基因座出現offladder 等位基因幾率稍小一些。有研究人員利用PowerPlex21 檢測系統對國內福建、湖南、山西、黑龍江等小樣本群體進行了遺傳調查并分析遺傳關系［24］。張檸等［25］采用PowerPlex21 檢測系統對云南苗族人群常染色體STR 基因座遺傳多態性調查中發現，D5S818 基因座的等位基因頻率分布差異較大。因此，對于較特殊的等位基因分型現象，例如等位基因丟失或off-ladder 等，由于檢測引物與擴增范圍及效率的不同，利用不同檢測體系對D5S818 基因座特殊等位基因分型的檢測效率也會有差異。由于PowerPlex21 研發的人群數據來源于西方人群，在中國人群的檢測使用中可能會出現由于多態性不同或者該基因座引物結合區DNA 位點屬于突變敏感區域，導致出現等位基因缺失的情況。因此，考慮研制較適合中國人群的D5S818 基因座擴增引物區域，完善體系檢測從而避免D5S818 基因座等位基因12 丟失的發生。

發生在孩子的等位基因丟失現象在實際檢測分析過程中容易被忽略，如果恰好被檢父與生母在該基因座中有相同的等位基因分型，孩子則能夠在父母中找到已經檢測到的未“丟失”的等位基因來源，則丟失等位基因的基因座由于符合遺傳規律而往往不容易被發現。另外一種情況，等位基因丟失容易被誤認為成“突變”，在鑒定實踐過程中被發現的等位基因丟失絕大多數屬于該種情形，本文中發現的5 個家系屬于此種情況，由于發生等位基因丟失的基因座“不符合遺傳規律”而被發現。當這種假突變是“多步突變”時，按照“突變”計算該基因座的PI 值，在“突變”步數較多的情況下計算得出的CPI 可能與實際的鑒定結論不符合。本文中其他4 個家系均容易誤認為在D5S818基因座發生了母源性突變而導致母子關系的誤判。但是本研究存在不足之處，由于5 個家系恰好都是母親或孩子發生的等位基因丟失，所以父子關系的判斷并沒有受到影響，未能研究分析父親發生等位基因丟失的情況。在今后的研究中應逐步積累增加分析的樣本量，進一步探討父親發生等位基因丟失對鑒定結果的影響。

因此，出現D5S818 基因座等位基因“不符合遺傳規律”的情況應查看電泳圖譜峰高辨別雜合與純合情況，同時分析孩子在該基因座的等位基因遺傳來源，注意分辨這種“突變”是否由于發生了等位基因12 的丟失所致，有條件時可以選擇有相同基因座檢測位點的商業化體系進行驗證。本文的研究經過多年檢測案例的經驗積累，對PowerPlex21 體系檢測出的D5S818 基因座“突變”一般采用Identifiler 體系檢測是否發生了等位基因12 丟失，并采用Identifiler 體系的檢測結果作為鑒定分析結果與鑒定結論的依據，從而規避可能影響鑒定結論的風險因素。