斑點叉尾腸道及其養殖環境菌群結構分析

熊向英，趙艷飛,2，王志成

(1.廣西海洋研究所有限責任公司，廣西 北海 536000；2.廣東海洋大學 水產學院 甲殼動物遺傳育種與增養殖實驗室，廣東 湛江 524088)

魚類腸道中存在著由大量細菌構成的微生物群落，是動物長期進化的結果。宿主為腸道菌群提供了棲息生存環境，腸道微生物則對宿主的免疫、健康、營養等有積極的影響[5]。魚類腸道菌群組成及平衡狀態與機體健康密切相關，如腸道微生物中的益生菌具有免疫刺激因子的作用，通激免疫器官發育、促進淋巴細胞免疫功能，進而提高機體的免疫水平[6]。同時養殖環境中存在大量有益微生物類群，這些微生物類群參與養殖系統的物質循環和水質調節，能直接影響養殖動物的健康狀況[7-8]。

1 材料與方法

1.1 養殖管理和水質檢測

試驗在廣西合浦縣黨江鎮南域村叉尾魚科技扶貧示范基地開展，養殖池塘面積約0.67 hm2，水深約1.3 m，放苗約4.2萬尾，養殖時間自8月初至次年7月底。每日早晚2次投喂漂浮性顆粒配合飼料，投喂量約為魚體質量的3%。養殖期間每隔2個月采用多功能水質分析儀YSI professional series測定池塘水溫、pH、溶解氧含量。采用TA-90紫外可見分光光度計(深圳市清時捷科技有限公司)測定氨氮和亞硝態氮含量。

1.2 樣品采集

試驗樣品采于2019年7月，分別收集成魚腸道和養殖水體2類樣品。隨機捕撈成魚3尾，平均體長30.1 cm，平均體質量294 g，樣品標記為N1～N3。采集水樣時池塘一周未換水，養殖水體取3個點，分別用有機玻璃采水器在池塘對角線兩側離岸1.5 m處及正中間位置采集水樣，每個點取樣1 L，分別標記為W1～W3。

1.3 樣品DNA提取、PCR擴增及高通量測序

1.4 數據分析

使用FLASH 1.2.11軟件對原始測序序列進行拼接，使用Trimmomatic 0.33軟件將拼接得到的序列進行質量過濾，并用UCHIME 8.1軟件去除嵌合體，得到高質量序列(Tags)。分析過程中刪除了古菌、葉綠體、未知序列以及只檢測到1次的序列。

1.4.1 運算分類單元聚類和物種注釋

利用USEARCH 10.0軟件對所有樣品的高質量序列進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為運算分類單元，參考SILVA的SSUrRNA數據庫對其進行物種注釋分析。

1.4.2 多樣性分析

通過Alpha多樣性分析，統計各樣品在97%相似性水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數，繪制樣品稀釋曲線和等級豐度曲線，研究單個樣品內部的物種多樣性。

1.4.3 功能基因預測

將測序數據經過Greengenes database 13.8數據庫比對后生成得運算分類單元表, 根據其16S rDNA拷貝數劃分的每個運算分類單元豐度將其均一化，通過PICRUSt預測微生物表型，如氧耐受、革蘭氏染色、致病潛力等。

2 結果與分析

2.1 養殖池塘水質指標

養殖期間池塘水質指標見表1，水溫、pH和溶解氧質量濃度(除2018年11月)均保持在穩定狀態。到養殖后期，池塘的氨氮和亞硝態氮質量濃度明顯升高，但均維持在較低水平。

表1 斑點叉尾池塘養殖水質指標

2.2 腸道和水環境中菌群的多樣性

表2 各樣品Alpha多樣性指數統計

等級分布曲線在橫軸的跨度表示樣品中細菌多樣性的豐富程度，在縱軸的平滑程度反映樣品中細菌分布的均勻程度。水體樣品細菌多樣性高于腸道，而腸道中則存在相對豐度明顯占優的細菌種類(圖1)。

圖1 各樣品中細菌多樣性的等級分布曲線Fig.1 Rank-abundance curves based on the OTU species number in each sample

2.3 腸道和水環境中菌群的相關性分析

圖2 腸道和水體中細菌數目的韋恩分析Fig.2 Venn analysis of bacterial number in intestine and pond water

2.4 微生物群落分析

圖3 基于門水平的樣品細菌相對豐度Fig.3 Relative abundance of phylum-level bacterial communities in different samples

圖4 樣品菌群在屬水平上的細菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of genus-level bacterial communities in different samples

2.5 細菌表型的預測

3 討 論

3.1 斑點叉尾腸道和養殖水體菌群多樣性和相關性分析

圖5 Bugbase預測細菌群落表型分析Fig.5 Bugbase prediction of bacterial community phenotype3條線自下而上分別代表下四分位、平均值和上四分位.The three lines represent the lower quartile, mean and upper quartile from bottom to top, respectively.

3.2 斑點叉尾腸道優勢菌群分析

3.3 斑點叉尾腸道和水體菌群表型預測

4 結 論