微生物發酵合成γ-PGA發酵條件優化

王風青，冉光雨

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000）

引 言

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是谷氨酸通過α-氨基與γ-羧基之間形成γ-酰胺鍵連接而成的高分子聚合物，其相對分子量為100～1000 kD[1-2]。γ-PGA 有3 種化學立體結構：D-谷氨酸組成的均聚物γ-(D)-PGA、L-谷氨酸組成的均聚物γ-(L)-PGA 以及D-型與L-型谷氨酸按不同比例組成的γ-(D,L)-PGA[3-4]。純品γ-PGA 的紫外吸收峰在216 nm 處，不同于蛋白質的紫外吸收峰280 nm 處[5]。楊革等[6]發現γ-PGA 的二級結構的80%是β-折疊和無規則卷曲。由于γ-PGA 主鏈上存在大量的游離親水性羧基，使得γ-PGA 分子內或分子間會形成水分子與谷氨酸殘基的氫鍵，從而讓聚合物具有優異的吸水保濕性能[7]。γ-PGA 的一些活性部位為某些材料的功能化實現給予了結合位點，因此在生理學上，可以通過添加γ-PGA 來防止細胞被蛋白酶降解并阻止細胞脫水[8]。

γ-PGA 與其他高聚物材料相比在綠色環保方面具有諸多優勢，讓其在眾多領域得到應用。γ-PGA 可在環保領域中使用，作為重金屬離子和放輻射性物質的契合劑[9]；添加鈣離子可減少γ-PGA的用量[10]；陽離子型γ-PGA 絮凝劑和氯化鐵復配改性，可以高效去除海水中總懸浮固體與化學需氧量[11]；王芳等[12]利用SY-Z5 巨大芽孢桿菌產生的生物絮凝劑與SY-ND 枯草芽孢桿菌產生的γ-PGA 復配能夠有效去除焦化廢水中65%的懸浮物。在食品領域，γ-PGA 能夠有效改善面制品耐凍性質、韌性和耐壓性[13-14]；也可用于增強葡萄的抗凍性[15]，還可以用于保護果汁中的雙歧桿菌細胞，從而使其存活率提高[16]；γ-PGA 完全水解后補充人體所需谷氨酸并增加食欲，同時也可以作為食品的增稠劑和除澀劑[17]。γ-PGA在應用于化妝品中能促進組織修復和細胞生長[18]；且γ-PGA 制成的化妝品具有良好的抗菌活性、提高皮膚免疫力、撫平肌膚細紋[19]以及改善發質[20]等作用。γ-PGA在醫療領域可用作手術縫線和醫用繃帶等[21]；γ-PGA 還能提高藥物的耐久性和藥物的有效性，控制藥物釋放速率[22]；γ-PGA靶向性可以通過糖基修飾得到增強且不會在體內產生積蓄和毒副作用[23]。在農業領域，γ-PGA 的使用能顯著提高種子的出苗率[24]，還可作為農藥、肥料的緩釋劑[25]；γ-PGA制成的吸水樹脂，可以有改善土壤特性和保濕性[26]；γ-PGA作為種子的理想包衣，從而提高種子的發芽率[27]。

基于此，首先通過單因素試驗確定較優因素，然后將較優因素利用Minitab19 軟件進行響應面設計找到最大γ-PGA 產量的最佳發酵條件，從而試圖解決γ-PGA生產過程中原材料消耗高、γ-PGA產量低的問題，這對γ-PGA的工業生產具有重要意義。

1 試驗方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌B.subtilisYSH18 是由實驗室分離冷藏的菌種；氯化鈉（AR），成都金山化學試劑有限公司；牛肉浸粉（AR），北京鴻潤寶順科技有限公司；無水氯化鈣（AR），西格瑪奧得里奇貿易有限公司；蛋白胨（生化試劑），北京奧博星生物技術有限責任公司；α-耐高溫淀粉酶（生化試劑），酷爾化學科技有限公司；糖化酶（生化試劑），酷爾化學科技有限公司；谷氨酸鈉（食品級），上海太太樂食品有限公司；磷酸氫二鉀（K2HPO4，AR），成都市科隆化學品有限公司；氫氧化鈉（AR），成都市科隆化學品有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，AR），上海麥克林生化科技有限公司；糊精（AR），成都市科隆化學品有限公司；玉米粉，市售；蔗糖（AR），成都市科隆化學品有限公司。

鼓風干燥箱（DHG-9070A），上海助藍儀器科技有限公司；電熱恒溫培養箱（H10-50BS），天津宏諾儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋（DY04-13-44-00），上海東亞壓力容器制造有限公司；氣浴振蕩器（THZ-A），上海助藍儀器科技有限公司；電子天平（FA2004N），杭州萬特電子儀器有限公司；生物潔凈工作臺（BCM-1000A），蘇州安泰空氣科技有限公司；電子天平（WT2002），杭州萬特衡器有限公司；萬用電爐（DL-1），北京市永光明醫療儀器有限公司；立式透明門冷藏柜（SC-240JA），青島海爾特種電冰柜有限公；pH 計（pHS-3E），上海儀電科學儀器股份有限公司；落地振蕩搖床（HZ-9610KB），太倉市華利達試驗設備有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1800），翱藝儀器（上海）有限公司；折光儀（LH-F90），杭州陸恒生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基與培養條件

種子培養基：蛋白胨濃度為10 g·L-1，牛肉浸粉濃度為3 g·L-1，葡萄糖濃度為20 g·L-1，氯化鈉濃度為10 g·L-1，水1000 mL，pH為7.0～8.0，裝液量50 mL/250 mL、轉速150 r/min、溫度37 ℃，振蕩培養18 h。

基礎發酵培養基：蛋白胨濃度為5 g·L-1，谷氨酸鈉濃度為30 g·L-1，氯化鈉濃度為3 g·L-1，磷酸氫二鉀濃度為1 g·L-1，玉米糖化液濃度（按可溶性固形物計）為40 g·L-1，裝液量50 mL/250 mL、轉速150 r/min、溫度37 ℃，搖床培養48 h。

搖瓶培養：2%（v/v）的接種量，50 mL/250 mL的裝液量，150 r/min的轉速，37 ℃的培養溫度，培養48 h。

1.2.2 玉米糖化液的制作

向鍋中加入3000 mL 水，再加入3.0 g 無水CaCl2，調節pH 值為6.7～7.0，加入3000 g 市售玉米粉，攪拌均勻，再加入2.5 g α-耐高溫淀粉酶（酶活為4000 U），加熱至80～85 ℃，保持溫度15～20 min，然后繼續冷卻至58～60 ℃。調節pH 值至4.5 左右，加糖化酶0.1 g（酶活為100 000 U），保持60 ℃左右加熱4 h，再煮沸10 min，用紗布過濾殘渣，再用棉花過濾，得到澄清玉米糖化液。測定還原糖濃度后，低溫保存備用。

1.2.3 單因素試驗

（1）不同碳源及濃度對γ-PGA 產量的影響：改變1.2.1 節“基礎發酵培養基”中玉米糖化液濃度為30、50、70、90、110 g·L-1與130 g·L-1（按可溶性固形物計）配制每組發酵培養基并平行3 組進行發酵。分別用糊精與蔗糖代替1.2.1 節“基礎發酵培養基”中的玉米糖化液，并按照糊精（或蔗糖）濃度為10、30、50、70、90 g·L-1與110 g·L-1配制每組發酵培養基并平行3 組進行發酵。發酵結束后以γ-PGA 的含量為指標確定最佳的碳源及其濃度。

（2）不同氮源及濃度對γ-PGA 產量的影響：分別用牛肉浸粉或酵母浸粉代替1.2.1節“基礎發酵培養基”中的蛋白胨，并按照牛肉浸粉濃度為10、30、50、70、90 g·L-1與110 g·L-1（或酵母浸粉濃度為5、7、9、11、13 g·L-1與15 g·L-1）配制每組發酵培養基并平行3 組進行發酵。發酵結束后以γ-PGA 的含量為指標確定最佳的氮源及其濃度。

（3）氯化鈉的濃度對γ-PGA 產量的影響：依據1.2.1節中“基礎發酵培養基”，改變基礎發酵培養基中的氯化鈉濃度分別為6、8、10、12、14 g·L-1與16 g·L-1，配制每組發酵培養基并平行3 組進行發酵，發酵結束后以γ-PGA 的含量為指標確定最佳的氯化鈉濃度。

（4）磷酸氫二鉀濃度對γ-PGA 產量的影響：依據1.2.1節中“基礎發酵培養基”，改變基礎發酵培養基中的磷酸氫二鉀濃度分別為1、2、3、4、5 g·L-1與6 g·L-1，配制每組發酵培養基并平行3 組進行發酵，發酵結束后以γ-PGA 的含量為指標確定最佳的磷酸氫二鉀濃度。

（5）前體物質谷氨酸鈉的濃度對γ-PGA 產量的影響：依據1.2.1 節中“基礎發酵培養基”，改變基礎發酵培養基中的谷氨酸鈉濃度分別為0、10、20、30、40 g·L-1與50 g·L-1，配制每組發酵培養基并平行3組進行發酵，發酵結束后以γ-PGA 的含量為指標確定最佳的谷氨酸鈉濃度。

1.2.4 Plackett-Burman設計

Plackett-Burman 設計比其他因子篩選方法更實用，能以較少的測試次數篩選出對響應值有顯著影響的因子。本試驗采用試驗次數為12 組的Plackett-Burman 設計，以γ-PGA 產量為響應值，選取影響γ-PGA 產量的5 個主要因素，其中，高水平“1”是低水平“-1”的1.5～2 倍。對試驗結果，首先各對因素的影響進行t檢驗。選α< 0.05 的因子作為顯著因子進行進一步研究。Plackett-Burman 試驗水平值見表1。

表1 Plackett-Burman設計各因素及其水平

1.2.5 最陡爬坡試驗

響應曲面需要考慮在一定范圍內的區域才能響應設計的可行性。當多個因子分別與各自的步長和方向進行移動時就可以大致找出這個范圍，而這個移動過程就是最陡爬坡試驗。依據Plackett-Burman 設計試驗結果，選取對γ-PGA 產量影響顯著的因素，設計對應的方向和步長。根據爬升方向上效應值的變化，如果有正效應，則取高水平再增加；如果有負效應，則取低水平，然后減少。步長可根據單因素試驗的變化來確定。

1.2.6 Box-Behnken響應面設計

確定顯著因素的最優水平：逼近最大γ-PGA 產量區后，進行Box-Behnken 響應面設計，以試驗結果擬合建立描述響應量（γ-PGA 產量）與自變量（影響γ-PGA 產量的顯著因素）關系的多項式回歸模型，再對擬合方程進行規范性分析，尋找回歸模型的穩定點，得到最大γ-PGA 產量時顯著因素的水平此即最優水平，并進行試驗驗證。Box-Behnken 設計的因素水平見表2。

表2 Box-Behnken設計的因素水平

1.3 分析方法

1.3.1 CTAB-NaOH 溶液的配置

用天平在準確稱取5.0000 g氫氧化鈉于燒杯中，加入少量去離子水使其完全溶解，然后倒入100 mL容量瓶中，再取少量去離子水沖洗燒杯并倒入容量瓶，重復兩次，最后用去離子水定容至100 mL，準確稱取CTAB 0.2000 g，倒入NaOH溶液中。

1.3.2 γ-PGA濃度的測定（CTAB比濁法）

（1）標準曲線的制備[28]：用標準γ-PGA 樣品配置成10、20、30、40 g·L-1與50 g·L-1的標液，分別與1.3.1 節配制的CTAB-NaOH 溶液1∶1 混合，室溫下反應時間約3 min 后，用預熱20 min 的紫外分光光度計在波長為250 nm 下測定其吸光度。繪制γ-PGA（g/L)-OD250nm標準曲線，如圖1所示。3 min 后，倒入石英比色皿，用水作為校準管。在預熱20 min 并設置波長250 nm 的紫外分光光度計下測定吸光度值（OD）。

圖1 γ-PGA標準曲線

1.3.3 可溶性固形物含量的測定

取適量液體于校準后的LH-F90 折光儀，對準光源，讀取數值[29]。

1.3.4 數據分析

所有單因素試驗，都進行3組平行試驗并重復3次，響應面試驗設計及數據分析，采用Minitab19 與Design Expert 11軟件完成。

2 結果與討論

（2）發酵液的測定：取稀釋的發酵液，加入等體積CTAB 溶液反應，并用旋渦震蕩儀震蕩。反應

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同碳源及濃度對合成γ-PGA的影響

微生物培養基中碳源的類型和濃度對于微生物的生長及其合成產物具有重要影響。碳源在微生物生長代謝中的主要作用是為細胞提供碳骨架，為細胞生命活動提供能量。因此，碳源在微生物培養基或細胞培養基中起著重要的作用。蔗糖、玉米糖化液和糊精對合成γ-PGA 的影響如圖2 所示。

圖2 不同碳源及濃度對合成γ-PGA產量的影響

由圖2 可知，3 種碳源濃度均為50 g/L 時，玉米糖化液的濃度對γ-PGA 的產量影響最大，為8.54 g/L，而其他兩種情況下的γ-PGA 的產量分別為4.98 g/L、5.25 g/L。這是因為采用雙酶法制備的玉米糖化液是將長鏈的淀粉第一次酶解成相對小分子的糊精和麥芽糖等二糖，再由糖化酶進一步酶解成更小的葡萄糖，因此玉米糖化液中除了有大量的葡萄糖外還有糊精和其他可利用碳源[30]。所以在同一濃度的不同碳源下，玉米糖化液具有更多的可利用碳源種類，使得其較糊精和蔗糖對微生物發酵有更大碳源的吸收效率，提供的營養更加全面。因此選擇50 g/L的玉米糖化液作為碳源較為適宜。

2.1.2 不同氮源及濃度對γ-PGA產量的影響

微生物生長和合成產物與氮源的種類和濃度息息相關，這能夠很大程度上影響次級代謝產物的產生。酵母浸粉、牛肉浸粉對合成γ-PGA 的影響如圖3所示。

圖3 不同氮源及濃度對γ-PGA產量的影響

從圖3 可知，γ-PGA 的產量在酵母浸粉濃度為11 g/L 時可達到9.04 g/L；γ-PGA 的產量在牛肉浸粉濃度為30 g/L 時僅為4.17 g/L。因此酵母浸粉在含量較小時就可以使γ-PGA 的產量達到較高水平；而牛肉浸粉含量越大特別是30 g/L 以后γ-PGA 的產量反而越小。張雷等[31]在進行Bacillus subtilis菌株發酵產γ-PGA 的培養基優化研究中發現在有機氮源中，酵母浸粉對γ-PGA 的產量的影響大于牛肉粉，且酵母浸粉營養成分為酵母來源，其營養結構與微生物較為相似。綜上所述，選擇11 g/L 的酵母浸粉作為氮源較為適宜。

2.1.3 氯化鈉、磷酸氫二鉀與谷氨酸鈉的濃度對γ-PGA產量的影響

氯化鈉可以調節滲透壓、pH值和氧化還原電位。氯化鈉的濃度對γ-PGA 產量的影響如圖4（a）所示。由圖可知，γ-PGA 的產量在氯化鈉濃度達到12 g/L時，γ-PGA 的產量最大，為6.55 g/L。而后γ-PGA 的產量隨著氯化鈉濃度增加反而下降，這可能是由于鹽濃度增加引起滲透壓增大，阻止了菌體正常的生命代謝活動。所以氯化鈉濃度選擇12 g/L。

磷酸氫二鉀具有促進菌體生長的作用[32]，磷酸氫二鉀的濃度對γ-PGA產量的影響如圖4（b）所示。由圖4（b）所知，磷酸氫二鉀濃度為4 g/L 時，γ-PGA的產量大幅增加，并在其濃度為5 g/L 時達到最大值，為5.20 g/L。所以磷酸氫二鉀的最佳濃度為5 g/L。

生產γ-PGA 的產量較低的一般為γ-PGA 產生菌非谷氨酸依賴型菌株，但是非谷氨酸依賴型菌株的使用，可以用少量的谷氨酸鈉作為前體物質得到大量的γ-PGA，這對于實際工業生產具有重要研究意義[33]。谷氨酸鈉濃度對γ-PGA 產量的影響如圖4（c）所示。由圖可知，當谷氨酸鈉濃度為0 時仍有γ-PGA 產生，這說明本研究所用的枯草芽孢桿菌B.subtilisYSH18 是一種非谷氨酸依賴型菌株，該類菌株添加少量谷氨酸鈉就可使γ-PGA 產量增加[28]。當谷氨酸鈉濃度為20 g/L時γ-PGA產量最大。

2.2 Plackett-Burman設計

利用minitab19 對試驗進行設計與分析分別見表3 與表4。由表4 可知，R2=0.9722=0.8889，= 0.9491，均接近于1，這說明擬合得到的多項式γ-PGA=9.712-0.1288A-0.06783B+0.1311C+0.0444D+0.0746E 與試驗很相符，可用來判別各種影響因素的顯著性。統計分析所得Pareto圖如圖5所示。

表3 Plackett-Burman設計及效應值(n=12)

表4 Plackett-Burman 設計的各因素的系數的估計及效應評價

圖5 帕累托標準化效應圖

由圖5可知，上述5個因素的重要性排序為B>C>A>D>E，即玉米糖化液>谷氨酸鈉>酵母浸粉>氯化鈉>磷酸氫二鉀。由表4 可知，酵母浸粉、玉米糖化液、谷氨酸鈉對γ-PGA 產量影響比較顯著（置信度大于95%，P< 0.05）。同時由表4 中T值可知，酵母浸粉和玉米糖化液對γ-PGA產量影響呈現負效應。

2.3 最陡爬坡試驗

由1.2.5 節的試驗方法，并取玉米糖化液、谷氨酸鈉、酵母浸粉的步長分別為-5、+5、-1，初始值分別為40、25 g/L與9 g/L，試驗結果見表5。

表5 最陡爬坡實設計及結果

由表5 可知，玉米糖化液濃度為30 g/L，谷氨酸鈉濃度為35 g/L，酵母浸粉濃度為7 g/L 時γ-PGA 產量最大，可以作為參考點中心值進行Box-Behnken響應面設計。

2.4 Box-Behnken響應面設計

利用Minitab19軟件對酵母浸粉、玉米糖化液和谷氨酸鈉進行3 因素3 水平的Box-Behnken 響應面設計，試驗結果見表6。

表6 Box-Behnken 試驗設計及結果

由minitab19回歸分析，γ-PGA產量對酵母浸粉（A）、玉米糖化液（B）和谷氨酸鈉（C）的多元二次回歸方程為：γ-PGA 產量（g/L）=-39.61+4.651A+0.8275B +1.2036C-0.4078A2-0.01089B2-0.01441C2+0.02025AB+0.01412AC-0.00945BC。

由響應值的方差分析（見表7）可知所選擇的回歸模型的P值為0.0002（< 0.1），并且R2= 0.9894，= 0.9704，= 0.8890、失擬項的P值為0.5350（> 0.05），這說明模型預測性良好且失擬程度不顯著，具有統計學意義。二次項C2、交互項AB、AC、BC對結果影響極顯著（P< 0.01）、一次項B對結果影響顯著（P< 0.05），表明各因素間對γ-PGA 產量的影響并不是簡單的線性關系[34]。

表7 響應值的方差分析

通過二次回歸方程及不同因素對γ-PGA 產量影響的3D 響應面圖（圖6）可知，二次項系數為負值，其所代表的拋物面開口向下，表明方程具有最大值。最適酵母浸粉濃度為7.0505 g/L、玉米糖化液濃度為29.0404 g/L、谷氨酸鈉濃度為35.6566 g/L時，γ-PGA 產量最大，為10.2636 g/L。為便于操作，將上述最優條件修正為酵母浸粉濃度為7 g/L、玉米糖化液濃度為30 g/L、谷氨酸鈉濃度為36 g/L。以此作為最優條件進行3 次重復試驗檢驗，測得γ-PGA 平均產量為10.2520 g/L，與預測產量擬合度達99.59%，表明優化模型可靠。

圖6 不同因素對γ-PGA產量影響的3D Surface圖

3 結束語

本文通過單因素及響應面試驗設計對發酵條件優化后，枯草芽孢桿菌B.subtilisYSH18 發酵合成γ-PGA 產量達到優化前的2 倍。微生物發酵合成γ-PGA 研究較多，但多數都因生產成本高而處于實驗室階段。本研究所用碳源及能源為低成本的玉米糖化液，為進一步降低成本，培養基中的谷氨酸鈉可以用價格更為低廉的味精生產原液或是味精廠廢液[35]等代替，從而進一步推進了微生物發酵合成γ-PGA產業化的進程。