恩施地區三種重樓屬植物活性成分與抗氧化活性研究

孫慧茹，譚生權，方昕悅，何美軍，何銀生，李 宇，張美德，楊 旭，4

（1.湖北省農業科學院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；3.恩施州中心醫院，湖北 恩施 445000；4.湖北生態工程職業技術學院/林下經濟湖北省工程研究中心，武漢 430200）

重樓為民間常用的名貴中藥材，來源于百合科重樓屬（Paris）植物，具有解毒、消炎、鎮痛、涼肝定驚的作用［1］。現代藥理學研究表明，重樓具有抗菌［2］、抗病毒［3］、止血［4］、驅蟲［5］、抗腫瘤［6］、抗氧化［7］、抗心血管疾病［8］和免疫調節［9］等功效，是云南白藥、宮血寧、季勝德蛇藥片等中成藥的主要原料［10］。重樓主要活性成分為甾體皂苷類化合物［11］，其中重樓皂苷Ⅱ是衡量藥材質量的重要指標之一，具有較強的免疫調節作用和抗腫瘤作用［12］。

重樓屬植物種類較多，但是目前藥典中規定能藥用的僅有七月一枝花［Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara］、云南重樓［Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand-Mazz］的干燥球莖［13］。這是由于不同重樓屬植物中的皂苷種類、皂苷含量以及抗氧化活性也有不同，直接影響重樓的抗腫瘤藥用功效［14，15］。七月一枝花、云南重樓，這2 種藥用重樓資源生長緩慢、產量低等瓶頸問題限制了其開發利用，通過篩選合適的替代藥用重樓屬物種是一種有效的解決辦法。本研究通過改進的氣相色譜法（GC），檢測3 個不同種重樓七月一枝花、啟良重樓（Paris qiliangianaH.Li，J.Yang & Y.H.Wang）、黑籽重樓（Paris thibeticaFranch.）中活性成分含量，并評價3 種重樓提取物DPPH 自由基清除活性能力，為重樓屬植物開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

5 年生啟良重樓、黑籽重樓、七葉一枝花藥材采集于恩施周邊地區，經湖北省農業科學院中藥材研究所由金文高級農藝師鑒定。標準品重樓皂苷Ⅱ購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙酸乙酯（色譜純）購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

DFY-1000 型中草藥磨粉機（溫嶺市林大機械有限公司）；Aglient Technologies 7890A 型氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測器FID、G4513A16 位自動液體進樣器、Agilent 19091S-433 型毛細管柱（HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm）（安捷倫科技有限公司）；RE-200A 型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 氣相色譜條件

檢測器為FID 檢測器。升溫程序：0～3 min，保持60 ℃；3.00～73.33 min，60 ℃→280 ℃，升溫速度3 ℃/min；73.33～93.33 min，保持280 ℃。進樣口溫度設置310 ℃，載氣為氮氣（99.999%），流速為1.0 mL/min。FID 設置溫度為280 ℃，設置進樣量為5 μL（分流比20∶1）。

1.4 溶液的制備

1）重樓皂苷Ⅱ標準品溶液配制，精密稱取重樓皂苷Ⅱ標準品32.8 mg，置于2 mL 棕色容量瓶，加乙酸乙酯定容，配置成16.4 mg/mL 的標準品溶液母液。

2）用乙酸乙酯對16.4 mg/mL 的標準品母液進行稀釋，得到濃度分別為16 400.0、8 200.0、4 100.0、2 050.0、1 025.0、512.5 ng/μL 的系列標準溶液。

3）供試樣品溶液配制，將七葉一枝花、黑籽重樓、啟良重樓根莖洗凈，60 ℃烘干，除須根后粉碎過65 目篩。按1∶50（m∶V）加入乙酸乙酯，500 W 超聲輔助提取（25 ℃，30 min），抽濾，13 000 r/min 離心10 min，吸取上清液備用分析。

1.5 重樓皂苷Ⅱ含量GC 檢測

標準品重樓皂苷Ⅱ線性關系考察，取“1.4”中稀釋系列標準溶液，按“1.3”的色譜條件GC 檢測進樣上述系列標準溶液，每組樣品進樣6 次重復。測定儀器信噪比（S/N），S/N= 3 對應濃度為GC 檢出限，S/N=10 對應濃度為GC 定量限。重復6 次進樣標準品計算峰面積的相對標準偏差（RSD），測試重復性；系統進樣配制的標準品6 個濃度樣品，得到重樓皂苷II 的標準曲線和R2值；同一個樣品重復6 次進樣，計算含量的相對標準偏差（RSD），測試精密度；已知濃度樣品添加已知標量，進樣檢測計算回收率（75%～120%）。采用GC 外標法檢測重樓中重樓皂苷Ⅱ的含量，計算公式如下。

式中，Cx為重樓中重樓皂苷Ⅱ的含量（mg/g）；CR為GC 外標法檢測濃度（μg/mL）；m為重樓干重（g）；V為樣品溶解體積（mL）。

1.6 抗氧化活性

參照Sharma 等［16］的方法，并稍有改進：①配制母液，分別取七葉一枝花、黑籽重樓、啟良重樓的提取物加無水乙醇配制成濃度為100 mg/mL 的母液。②加無水乙醇稀釋成系列濃度的重樓提取物溶液，稀釋濃度為1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L；③重樓提取物溶液試驗組（Test Group，TG），取3 mL 重樓提取物樣品溶液加入1 mL 濃度為200 μmol/L 的DPPH溶液混勻，置于水浴鍋中，在30 ℃下避光反應30 min；對應設置，取3 mL 重樓提取物樣品溶液加入1 mL無水乙醇溶液混勻，相同處理扣除背景吸收（Subtracting background absorption，SBA）。另設置抗壞血酸、DPPH 分別為陽性對照組（Positive control group，PCG）和空白組（Blank control group，BCG）。在517 nm下檢測吸光度，計算樣品清除DPPH 自由基的百分率（Clearance，CL）。

2 結果與分析

2.1 重樓屬植物中重樓皂苷Ⅱ的鑒定

通過GC 檢測重樓屬植物樣品，得到重樓皂苷Ⅱ（Rt）標準品的保留時間為69.783 min，與黑籽重樓、七月一枝花、啟良重樓3 個重樓屬植物供試溶液中色譜峰的保留時間（69.773、69.779、69.776）min基本一致，如圖1 所示。通過保留時間鑒定這3 個吸收峰為重樓皂苷Ⅱ。

圖1 重樓樣品與重樓皂苷II的色譜圖

2.2 標準曲線的繪制和線性關系的考察

將濃度為16 400.0、8 200.0、4 100.0、2 050.0、1 025.0、512.5 ng/μL 重樓皂苷Ⅱ標準品溶液分別進樣5 μL，用FID 檢測器進行檢測分析，測定各色譜峰的峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），以標準液溶液濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸分析，得到重樓皂苷Ⅱ標準品的標準曲線為Y=0.845X+72.18，如圖2所示，得到R2為0.999 5，重樓皂苷Ⅱ標準品溶液在濃度為512.5～16 400.0 ng/μL 時，線性相關性好。

圖2 重樓皂苷Ⅱ的標準曲線

2.3 精密度與回收率試驗

通過信噪比計算，得到檢出限（DL）為40.5 ng/μL，定量限（QL）為130.6 ng/μL。通過標準曲線得到重樓皂苷Ⅱ的含量，再計算出其相對標準偏差值（RSD）為2.72%，結果見表1，RSD＜5%，可見此方法的精密度良好，可滿足進一步分析的要求。

表1 標準品精密度試驗結果（n=6）

加樣回收率結果見表2，重樓皂苷Ⅱ的加樣回收率為96.93%～98.33%，表明本方法準確可靠，可以滿足測定的要求。

表2 回收率試驗結果（n=3）

2.4 不同種重樓中重樓皂苷Ⅱ含量的比較

利用GC 外標法檢測重樓屬植物中重樓皂苷Ⅱ的含量，由表3 可知，3 種樣品重樓皂苷Ⅱ含量存在明顯差異，七葉一枝花為0.104 mg/g，黑籽重樓為0.098 mg/g、啟良重樓為0.015 mg/g，七葉一枝花與黑籽重樓的重樓皂苷Ⅱ含量顯著大于啟良重樓。表明七葉一枝花中的活性成分重樓皂苷Ⅱ含量最高，其次是黑籽重樓，啟良重樓的含量最低。

表3 不同種重樓中重樓皂苷Ⅱ含量的比較（n=3）

2.5 抗氧化試驗結果

3 種重樓提取物均有DPPH 自由基清除活性，在試驗所選取的濃度范圍內，3 種樣品DPPH 清除能力都隨濃度增加而增強，且七葉一枝花提取物DPPH自由基清除活性最強，其IC50為2.372 mg/mL，其次是啟良重樓和黑籽重樓，其IC50分別為2.461、2.473 mg/mL（圖3）。3 種重樓提取物抗DPPH 自由基清除活性都比抗壞血酸強（IC50為6.432 mg/L）。

圖3 重樓提取物及抗壞血酸的DPPH 清除活性

3 討論

重樓皂苷Ⅱ具有重要的藥理活性，現代藥理學研究表明，重樓皂苷Ⅱ可減少細胞內活性氧產生和提高SOD 活性，從而對高糖干預下的GMC 增殖有一定抑制作用，并可減輕細胞氧化應激損傷［17］。重樓皂苷Ⅱ可聯合CPT 作用于H446 細胞，作為CPT 的增敏劑用于肺癌方面的治療［18］。目前，用于重樓皂苷檢測的技術主要有超高效液相串聯四極桿飛行時間質譜法（UPLC-QTOF-MS/MS）［19］、高效液相色譜-蒸發光散射檢測法（HPLC-ELSD）［20，21］、分光光度法等，但是UPLC-QTOF-MS/MS 檢測法需要較高的測試成本，HPLC-ELSD 與分光光度法存在重復性、準確性差等問題。

通過DPPH 清除試驗發現，3 種重樓提取物都有一定的抗氧化功能，且七葉一枝花提取物DPPH 自由基清除活性最強。運用GC 技術對于恩施地區七葉一枝花、啟良重樓、黑籽重樓中重樓皂苷Ⅱ成分的含量進行檢測分析，發現該方法精密度高、操作簡單，可用于重樓樣品大規模分析檢測；發現七葉一枝花中重樓皂苷Ⅱ的含量為0.104 mg/g，黑籽重樓中重樓皂苷Ⅱ的含量為0.098 mg/g，可以為開發黑籽重樓替代七葉一枝花藥材、緩解重樓資源危機提供參考。