鐵、錳缺素脅迫對辣椒葉綠素熒光參數和反射光譜曲線的影響

白如月，耿 亞，王孝剛，劉志軍

（1.南京信息職業技術學院電子信息學院，南京 210031；2.南京海康威視數字技術股份有限公司，南京 210031）

辣椒是中國最主要的蔬菜作物之一。隨著設施農業技術的發展，溫室辣椒無土栽培因其方便管理、防疫病、作物質量高、節約環保等優點，成為中國辣椒生產的重要方式［1，2］。由于辣椒生長速度快、產量高，生產中易忽視對基質微量元素的補充，勢必造成辣椒微量元素缺乏，嚴重影響產量與品質［3，4］。作物微量元素缺乏癥多數可通過外觀作出診斷，而作物缺鐵及缺錳均表現為葉片新葉的葉脈仍綠、葉脈間失綠，且鐵錳雙缺素復合癥狀較為復雜，病情相互影響和掩蓋，在生產中難以鑒別［5-7］。針對作物微量元素的傳統檢測方法為化學分析法，但其流程繁瑣、時效性差、成本高、損傷葉片，不利于作物缺素及時診斷及矯治［8］。

近年來迅速興起的植物生理信息檢測技術主要為葉綠素熒光技術及高光譜技術，葉綠素熒光被譽為植物光合作用的天然探針，與內部的光合過程密切偶聯［9，10］；反射光譜曲線可通過不同波段的光譜反射率反映植物生長的重要信息［11，12］。葉綠素熒光技術及高光譜技術具有速度快、效率高、精確、無損等優點，廣泛應用于農業品質鑒定、病害檢測和估產的研究中［13，14］。本研究以辣椒為試驗對象，采用智能溫室水培法精準控制環境變量與鐵、錳濃度，對缺鐵、缺錳及鐵錳雙缺素處理的辣椒葉片葉綠素熒光動力學參數及葉片反射光譜曲線展開了研究，并建立了基于支持向量機（Support Vector Machine，SVM）的辣椒缺素類型診斷模型，旨在為使用現代物理技術和農業工程技術對溫室辣椒鐵、錳缺素的快速診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間為2020 年6 月20 日至8 月1 日，試驗地點為南京農業大學工學院的Venlo 溫室，配有Eco-Watch（Dynamax）生態環境監測系統，實現對內、外遮陽、天窗及噴淋系統的監控。試驗品種為凱瑟琳甜椒，使用普通水培以精準控制微量元素濃度，使用鵝蛋型透明水培容器，營養液選用日本山崎甜椒配方。所用分析純藥品有硝酸鉀、硝酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫銨、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅和鉬酸鈉，鐵、錳元素來源分別選用乙二胺四乙酸鐵鈉與硫酸錳，營養液電導率為1.1 mS/cm，使用氣提式充氧法每天補充營養液氧含量15 min，每周更換一次營養液（圖1）。使用儀器主要有MINI-PAM-Ⅱ葉綠素熒光儀、CI-720 光纖光譜儀、Spad-502 葉綠素儀、電導率儀等。

圖1 水培辣椒

1.2 試驗設計

隨機選取30 株長勢近似的幼苗為試驗對象，進行不同的缺素處理。設置缺鐵素組、缺錳素組、鐵錳雙缺組3 個控制組平行處理，每組均設50%（-Fe1、-Mn1、-FeMn1）、25%（-Fe2、-Mn2、-FeMn2）、0（-Fe3、-Mn3、-FeMn3）3 個水平，并設置對照組（CK，即不缺元素），共10 個處理，每個處理組2 株重復。辣椒生長過程中無其他環境脅迫。辣椒在處理一周后（6 月26 日）開始測量參數，SPAD 值、葉綠素熒光參數與反射光譜曲線每周測量一次，測量時間為夜晚20：00—23：00，以保證辣椒葉片充分暗適應及相同的LED 作用光環境，避免背景噪音對反射光譜曲線的影響。每株植物測量自頂部完全展開的3片新葉。

1.3 葉綠素熒光參數的測定

葉綠素熒光參數測量儀器為MINI-PAM-Ⅱ葉綠素熒光儀（WALZ，德國），設定飽和光為10（PDF約為6 000 μmol/L），作用光為5（PDF約為126 μmol/L），作用光穩定時間為3 min。所測葉綠素熒光原始參數為初始熒光（Fo）、光下最小熒光（Fo′）、最大熒光（Fm）、光下最大熒光（Fm′）、穩態熒光（Fa）；葉綠素熒光比值參數PSⅡ最大光化學量子產量（Fv/Fm）、PSⅡ實際光化學量子產量（Y（Ⅱ）），光化學猝滅系數（qL）和非光化學猝滅系數（NPQ）均由儀器自動計算得出；測定時，使用葉夾固定葉片的ROI 區域，葉片充分暗適應后，開啟飽和脈沖獲得暗參數，暗恢復30 s后使用作用光光化3 min，再次開啟飽和脈沖測定光參數，最后打開遠紅光測定Fo′。測量時，選取每個葉片葉脈兩側及葉尖3 個位置取平均值。

1.4 反射光譜曲線的測定

反射光譜曲線使用CI-710 光纖光譜儀獲取，波譜范圍為400～1 000 nm，光學分辨率為2.0 nm，設定積分時間為600 ms，平均掃描次數為2。葉片測量區域與葉綠素熒光參數的測量區域保持一致，每次使用前，使用標準反射板標定CI-710。各高光譜特征參數包括花青素反射指數（ARI）、歸一化植被指數（NDVI）、紅邊指 數1（VREI1）、光化學 植被指數（PRI）、植物衰減指數（PSRI）、變異的CAR指數（TCARI）、結構強化色素指數（SIPI）、紅邊歸一化植被指數（RENDVI）、標準化葉綠素指數（NPCI）、胡蘿卜素反射指數（CRI），且各參數可由軟件自動計算得出。

1.5 數據分析方法

反射光譜曲線的處理與高光譜特征參數計算在CID-710 官方軟件SpectraSnap 內進行，采用Excel 2015 和MATLAB 14.0 軟件進行數據處理并作圖，并利用SPSS Statistics 20.0 軟件對數據進行顯著性分析，采用Tukey HS 方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 鐵、錳缺素對辣椒葉片SPAD 值的影響

葉片SPAD 值是衡量葉綠素相對含量的參數，可表示植物的綠色程度。由圖2 可以看出，對照組辣椒葉片在生長過程中SPAD 值逐漸增加，鐵、錳缺素對SPAD 值的影響因缺素種類與缺素水平而異。在3 組缺素處理中，隨著缺素水平的增加，缺鐵、缺錳與雙缺組葉片SPAD 值均呈下降趨勢，下降程度為-FeMn＞-Fe＞-Mn。缺素處理14 d后，-Fe3、-FeMn2和-FeMn3 處理的SPAD 值顯著低于CK（P＜0.05）。缺素處理21 d后，-Fe2、-Fe3、-Mn3、-FeMn2和-FeMn3處理的SPAD 值均顯著低于CK，其中-Fe2、-Mn3、FeMn2 處理的SPAD 值分別為對照組的87.13%、83.67%和79.3%，黃化癥狀較為嚴重的-Fe3、-FeMn3處理的SPAD 值僅為對照組的50.33%和28.71%。說明辣椒葉片缺鐵較缺錳造成的葉綠素含量下降更為嚴重，而鐵錳雙缺會明顯加劇辣椒的黃化程度。在全部測量周期中，-Fe1、-Mn1、-Mn2、-FeMn1 處理的SPAD 值與對照組差異不顯著。

圖2 不同缺素處理對辣椒葉片SPAD 值的影響

2.2 鐵、錳缺素對辣椒葉片葉綠素熒光參數的影響

隨著處理時間的增加，缺鐵、缺錳及鐵錳雙缺組0 水平的各葉綠素熒光參數表現出規律的變化，其他處理與CK 組的葉綠素熒光參數無明顯變化，所以選擇-FeMn3、-Mn3、-Fe3 3 個處理進一步分析。

由表1可知，辣椒葉片3個處理組的Y（Ⅱ）、Fv/Fm與NPQ在測量周期內均低于CK，且隨著處理時間的增加，Y（Ⅱ）、Fv/Fm與NPQ波動式減小。辣椒葉片的Y（Ⅱ）在21、28、、35 d 時下降趨勢為-FeMn3＞-Mn3＞-Fe3；Fv/Fm在14、21 d 時，下降趨勢為-Mn3＞-FeMn3＞-Fe3，28 d 后 為-FeMn3＞-Mn3＞-Fe3；NPQ在14、21 d 時，下 降 趨 勢 為-Mn3＞-Fe3＞-FeMn3，35 d 時為-FeMn3＞-Mn3＞-Fe3。部分處理時間，辣椒葉片-Fe3 處理和-FeMn3 處理的qL低于CK。

表1 不同缺素處理對辣椒葉片葉綠素熒光參數的影響

方差分析后發現，缺素處理7 d 前，各處理葉綠素熒光參數與對照組差異均不顯著，-Mn3 處理的Fv/Fm與-FeMn3 處理的Fv/Fm、qL在缺素處理14 d 后與CK達到顯著差異；-Fe3處理的Y（Ⅱ）、Fv/Fm，-Mn3處理的Y（Ⅱ）、NPQ和-FeMn3 處理的Y（Ⅱ）在缺素處理21 d 時與CK 達到顯著差異。說明使用葉綠素熒光參數檢測植物鐵、錳缺素是可行的，但參數變化趨勢較復雜，前期靈敏度不如后期高。

2.3 鐵、錳缺素對辣椒葉片反射光譜曲線的影響

不同處理組的高光譜特征參數均出現了有規律的變化。如表2 所示，缺鐵處理組的ARI、NDVI、VREI1、PSRI、SIPI、RENDVI、CRI，缺錳處理組的NDVI、VREI1、SIPI、RENDVI、CRI以 及鐵 錳雙 缺 組的ARI、NDVI、VREI1、PRI、RENDVI、SIPI、CRI均低于對照組（CK），且隨著缺素水平的增加大體上呈下降趨勢；缺鐵處理組的TCARI，缺錳處理的TCARI、NPCI以及鐵錳雙缺組的TCARI、NPCI高于對照組；方差分析后發現，各處理組50%水平的光譜特征參數均未與對照組（CK）達到顯著差異，25%水平中-FeMn2處理的VREI1、PSRI、RENDVI、NPCI和-Mn2 處理的NPCI與對照組（CK）差異顯著，0 水平中除-Mn3 處理與CK 的PRI差異不顯著外，各處理所有光譜特征參數均與對照組（CK）達到顯著差異。說明高光譜特征參數能較好地響應植物鐵、錳及其復合缺素脅迫。

表2 不同缺素處理對辣椒葉片高光譜特征參數的影響

缺素處理前期，各處理的反射光譜曲線差異不明顯，缺素處理21 d 后，不同時期各處理的反射光譜曲線變化趨勢基本一致，為此，主要取缺素處理21 d的樣本反射率波形進行分析。圖3 為各處理組不同水平的反射光譜曲線，可以看出，不同處理的反射光譜曲線波形基本相似，但在可見光波段（460～710 nm）的反射率值差異較大，在“綠峰”（550 nm 左右）處的反射率值差異最為明顯。隨著缺素水平的增加，各處理在可見光波段的反射率呈上升趨勢，鐵錳雙缺對光譜反射率影響最大，缺鐵次之，缺錳最小。缺鐵與鐵錳雙缺會造成反射光譜曲線的“紅邊”向短波方向偏移，但各處理在紅外波段（760～1 000 nm）的差異不顯著。

圖3 不同缺素處理對辣椒葉片反射光譜曲線的影響

2.4 基于SVM 的缺素類別診斷模型

利用LIBVM 3.1 工具箱進行SVM 分類建模，選用徑向基函數（式1）作為模型的核函數，邊界函數c和核寬度g采用交叉驗證（Cross validation）法獲取。隨機選取各時期缺鐵組、缺錳組與鐵錳雙缺組黃化葉片（SPAD＜40）樣本各50 組，其中30 組作為訓練集，20 組作為檢驗集。分別對樣本SPAD、葉綠素熒光參數與光譜特征參數進行歸一化處理，作為建立SVM 分類模型的特征參數。

式中，k為徑向距離函數，x為空間某點；xc為核函數中心；g為核寬度。

由表3 可知，在2 種輸入模式下，模型均對辣椒葉片缺素類型有很好的分類能力，SPAD+葉綠素熒光參數全分類準確率可達到90%以上，SPAD+光譜特征參數全分類準確率可達到85% 以上。以SPAD+葉綠素熒光參數作為輸入在鑒別缺鐵與鐵錳雙缺樣本時有較高的準確率；以SPAD+光譜特征參數作為輸入可更準確地鑒別缺鐵與缺錳、缺錳與鐵錳雙缺樣本。說明使用基于葉綠素熒光參數與光譜特征參數的SVM 模型診斷辣椒鐵、錳缺素癥是可行的。

表3 不同輸入下SVM 模型對缺素類型的分類準確率

3 小結與討論

鐵元素與錳元素均為植物體內多種酶的組成部分，影響蛋白質、碳水化合物與脂類的合成，直接和間接參與光合作用的光能吸收、電子傳遞及干物質積累等過程，嚴重影響作物的生產質量。鐵、錳缺素癥的錯誤矯治不僅不利于恢復作物健康，甚至會造成鐵、錳元素毒害。因此，結合現代物理檢測手段及農業工程技術，對植物鐵、錳缺素癥作出快速、有效診斷是當務之急。

試驗各控制組50%水平的每種參數均未與對照組達到顯著水平，這與試驗樣本品種、試驗環境和設備檢測精度等因素有關。缺素葉片的SPAD 值降低，表明缺素植物的葉綠素合成受阻，鐵錳雙缺組同水平的SPAD 值顯著低于缺鐵組與缺錳組，說明在鐵、錳復合缺素影響下辣椒受到了更為嚴重的脅迫。當葉片SPAD 值降至約40 以下時，可憑肉眼明顯觀察到辣椒葉片黃化癥。

Y（Ⅱ）反映了光合機構在當前作用光（本研究中為126 μmol/L 藍光）下的光能轉化效率，Fv/Fm反映了植物的潛在最大化光能轉化效率，在植物的脅迫檢測中應用廣泛。缺素處理后葉片的Y（Ⅱ）與Fv/Fm下降，說明葉片吸收的量子中參與PSⅡ光化學反映的比例下降，植物光合系統受到破壞。qL與NPQ分別表示PSⅡ積累量子中用于光合作用的部分和轉化為熱能的部分。缺錳處理的qL升高，可能原因是植物在缺錳脅迫下為提升光合作用作出的適應性反應，而當鐵、錳復合缺素時該適應能力喪失，qL下降。缺素處理下NPQ下降說明植物光保護能力降低。葉片光譜反射率在可見光波段主要受葉綠素含量的影響，在紅外波段則主要受葉片細胞結構的影響。隨著缺素水平與缺素時間的增加，葉片在可見光波段的反射率呈上升趨勢，且鐵錳雙缺組＞缺鐵組＞缺錳組，這與SPAD 值的變化趨勢一致。鐵、錳缺素均未對紅外波段的光譜反射率造成影響，說明葉片的細胞結構無明顯變化。

支持向量機是一種以統計學理論為基礎，以結構風險最小化為目標，實現對數據深層信息進行挖掘的新方法，在小樣本回歸分析和模式識別中表現出良好的準確性。在鑒別缺鐵組與雙缺組時，使用葉綠素熒光參數為輸入的模型準確率較高；鑒別缺鐵組與缺錳組、缺錳組與雙缺組時，使用光譜特征參數為輸入的模型準確率較高。說明缺鐵與鐵錳雙缺葉片的光能吸收、傳遞、耗散、分配等過程差異較為明顯，而缺鐵組與缺錳組、缺錳組與雙缺組的葉片表觀性差異較為明顯。因此，在實際應用時，應充分結合葉綠素熒光技術與高光譜技術各自的優點，從而對溫室辣椒的缺素類型作出更準確的診斷。

本研究分析了溫室辣椒缺鐵、缺錳及鐵錳雙缺素對葉片葉綠素熒光參數與反射光譜曲線的影響，并使用支持向量機針對出現黃化的葉片建立了缺素種類快速診斷模型，證明使用葉綠素熒光技術與高光譜技術診斷溫室辣椒鐵、錳缺素癥是可行的。