放流前大麻哈魚幼魚頭腎和脾臟的組織學觀察

李培倫，劉 偉，魯萬橋，唐富江，王繼隆

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070）

魚類的免疫系統主要由免疫器官、免疫細胞及體液相關免疫因子構成，其中頭腎和脾臟是魚體重要的免疫器官和造血器官，也是抗體產生、中性粒細胞生成和紅細胞發生的場所［1-3］。目前，國內外已有關于銀鯧（Pampus argenteus）［3］、金頭鯛（Sparus aurata）［4］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［5］、駝背鱸（Cromileptes altivelis）［6］、四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）［7］等魚類免疫器官形態組織結構的研究報道，指出不同種屬魚類物種之間其免疫器官在形態、大小及組織結構等方面存在著明顯差異，也是長期進化過程中與其棲息生境條件相適應的結果［6］。同時，采用解剖學、組織學等方法研究魚類免疫器官組織結構特征是臨床診斷魚類疾病的有效方法，也可為發展水產品健康養殖提供直觀依據。

大麻哈魚（Oncorhynchus keta），屬鮭形目（Salmoniformes）鮭 科（Salmonidae）大 麻 哈 魚 屬（Oncorhynchus），俗稱大馬哈魚、太平洋鮭、秋鮭等，其分布范圍介于北緯35°—73°、東經120°—123°，為典型的溯河生殖洄游型冷水性魚類，終生只繁殖一次，繁殖后親本死亡［8］。中國境內大麻哈魚僅分布于黑龍江、烏蘇里江、圖們江和綏芬河水域。近年來，由于人為捕撈強度大、全球氣候變遷及修建各類水利工程等因素導致其生存空間萎縮、產卵場缺失、資源儲量嚴重下降［9-11］。針對上述問題，中國政府有關部門每年4—5 月在大麻哈魚的原始棲息水域積極開展人工增殖放流以恢復其種群資源，并取得顯著成效［12，13］。目前，有關大麻哈魚幼魚的研究涉及生長特征［14，15］、鹽度脅迫［16，17］、耳石標記［18］等方面，而有關其免疫器官形態組織學方面未見報道，本研究對放流前大麻哈魚幼魚的頭腎和脾臟進行了形態結構觀察，不僅能夠豐富魚類免疫器官形態結構相關資料，還可為探索大麻哈魚放流苗種培育過程中魚體免疫應答機理提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用大麻哈魚幼魚來自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所湯原大麻哈魚孵化繁育基地，選取10 尾生長狀況良好的個體作為試驗樣本，其叉長為（5.31±0.34）cm、體質量為（1.52±0.37）g。

1.2 試驗方法

使用MS-222 型麻醉劑麻醉魚體后測量其叉長、體質量，分別精確到0.01 cm 和0.01 g。解剖魚體，將完整的脾臟置于波恩試液中，后取出消化道并切掉魚體頭部、尾部及背部肌肉，將剩余部分全部置于波恩試液中固定24 h，然后剝離頭腎組織，將頭腎和脾臟分別置入75%乙醇溶液中保存。

固定的頭腎和脾臟組織經75%～100%乙醇溶液脫水后，二甲苯透明、石蠟包埋、SLEE 切片機切片（厚度6 μm），切片經二甲苯脫蠟后進行蘇木精-伊紅染色、乙醇溶液梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片保存。Carl Zeiss 光學顯微鏡觀察、SZSS2000 型顯微拍照系統對組織進行拍照。

2 結果與分析

2.1 頭腎的形態組織結構

大麻哈魚幼魚的腎臟形態為扁平長條形，位于消化道背上方，緊貼體腔背側，前端膨大，可分為頭腎和體腎兩部分，其中最前端膨大為釘子狀的是頭腎，紅褐色、稍扁平。此外，頭腎在體腔內位于心腹隔膜前的食道背面、胸腔內咽退縮肌上方。大麻哈魚腎臟中頭腎與體腎之間無明顯的區分界限，是一個連續的整體。

大麻哈魚的頭腎外層覆蓋有一層致密結締組織形成的被膜，深褐色，內含少量淋巴細胞、中性粒細胞等，頭腎實質為網狀結構，實質中無明顯的小梁（圖1a）。頭腎實質主要由淋巴細胞聚集區、粒細胞聚集區、腎小管及血竇等組成（圖1b）。淋巴細胞聚集區主要由大淋巴細胞和小淋巴細胞構成，其中小淋巴細胞體積較小、細胞質少，較大的細胞核幾乎占據了整個細胞，嗜堿性強被染成深藍色，與小淋巴細胞相比，大淋巴細胞的體積稍大、細胞質稍多。粒細胞聚集區主要由中性粒細胞組成，體積較大，多為圓形或不規則的圓形，細胞核較大且偏居一側，細胞質幾乎不著色。血竇組織明顯，由聚集成片的紅細胞、淋巴細胞及扁平細胞構成（圖1b）。黑色素巨噬細胞無規律分散在腎實質中，巨噬細胞的細胞核大，幾乎看不到細胞質，染色呈黃褐色，大量的巨噬細胞聚集在一起形成了黑色素巨噬細胞中心，呈光亮的黃褐色斑塊兒（圖1c、圖1d）。頭腎實質中能夠明顯看到少量腎小管及較多退化的腎小管，其中腎小管內壁為圓形的上皮細胞，排列整齊呈圓形或橢圓形，而退化的腎小管內上皮細胞排列疏松、腎管組織結構模糊（圖1c）。頭腎實質中靜脈血管管腔較大，內含大量成熟和不成熟的紅細胞，且在靜脈血管壁周邊看到了由排列緊密的腎上腺細胞聚集形成的小團狀的腎上組織結構，腎上腺細胞胞體大而胞核小，且染色較淺（圖1d）。

2.2 脾臟的形態組織結構

大麻哈魚幼魚的脾臟較小，為扁平不規則的橢圓狀，位于胃組織的下方，腸道中部背面，顏色呈暗紅色，表面光滑，背面稍凸，腹面平滑。大麻哈魚幼魚脾臟外具有一層較薄的被膜，主要由薄層結締組織和一層扁平上皮細胞構成（圖2a）。被膜以下為脾臟的實質部分，未見明顯的脾小葉和脾小梁，但血管豐富，中央靜脈及動脈血管可貫穿整個脾臟，其中靜脈血管的管腔較大，但管壁薄，而動脈多附著于中央靜脈血管邊上，管腔較小，但管壁較厚，主要由平滑肌和扁平上皮細胞構成（圖2b）。脾臟實質主要由分界不明顯的紅髓和白髓交替分布形成密集的網狀結構，其中紅髓區域所占面積較大，內含大量紅細胞及少量淋巴細胞和巨噬細胞，而白髓所占面積較小，內含大量淋巴細胞和中性粒細胞，其中小淋巴細胞和中性粒細胞居多（圖2a、圖2c）。黑色素巨噬細胞較多，黃褐色，在脾臟實質中分布無明顯規律，靜脈、血竇、紅髓等結構中均有（圖2c、圖2d）。脾實質中血竇較多，血竇主要由血細胞成片聚集而成，其形狀、大小不一，相鄰兩個血竇之間為網狀纖維組成的脾竇，無固定形態，而脾索分布于脾竇的周圍，呈長短不一的條索狀，由淋巴細胞、長桿形的內皮細胞及結締組織組成（圖2d）。

圖2 放流前大麻哈魚幼魚脾臟的組織學結構

3 小結與討論

3.1 頭腎的組織特點和功能

魚類的腎臟可分為頭腎和體腎兩部分，其中絕大部分魚類的頭腎在魚體生長發育過程中會逐漸失去泌尿排泄功能，但卻保持了發達的免疫功能和造血功能，如黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［2］出膜后26～43 d 頭腎中腎小管逐漸萎縮消失；2 月齡斑馬魚（Danio rerio）［19］頭腎實質中的腎單位開始退化，1 齡時退化完全；草魚（Ctenopharyngodon idella）［20］頭腎在孵化后2 d 出現腎小管，6 d 出現造血干細胞及淋巴母細胞樣細胞，85 d 腎小管完全消失，而成年彈涂魚（Periophthalmus koelreuteri）［21］等少數魚類的頭腎中仍保留腎單位，無退化消失現象。大多數魚類的頭腎可分為3 個功能期，分別為單純的泌尿功能期、泌尿與免疫混合功能期及單純的免疫功能期［22］，而本研究中放流前大麻哈魚的頭腎實質中能看到腎小管及退化的腎小管，表明該時期大麻哈魚幼魚的頭腎處于泌尿與免疫混合功能期。魚類的頭腎在形態結構上有所差別，大麻哈魚的頭腎與體腎之間無明顯區分界限，是一個連續的整體，該結構特點與池沼公魚（Hypomesus olidus）、花鱸（Lateolabrax japonicus）等［23］魚類相同，與銀鯧［3］、駝背鱸［6］、鯔（Mugil cephalus）［24］等魚類的頭腎和體腎被心腹隔膜分隔開不同。

大麻哈魚頭腎外周具有一層被膜，與駝背鱸［6］、鯔［24］等魚類相似，不同于斜帶石斑魚［5］、花鱸［23］等魚類的頭腎外周僅有一層較薄的膠原纖維包裹。大麻哈魚幼魚頭腎實質為網狀結構，無明顯小梁，含有淋巴細胞聚集區、粒細胞聚集區及血竇等，與駝背鱸［6］、四指馬鲅［7］等魚類的頭腎結構相似。免疫細胞是機體參與免疫反應或與應答相關的細胞，分為參與特異性免疫反應的淋巴細胞和參與非特異性免疫反應的中性粒細胞、巨噬細胞等［25］。胡玲玲等［26］研究指出巨噬細胞內含有棕黃色顆粒和少量淋巴細胞，不僅能夠參與免疫應答反應，又具有貯存血黃素、吞噬可溶性顆粒物質的功能。本研究中大麻哈魚幼魚肝臟實質中含有大、小淋巴細胞、中性粒細胞、棕褐色的黑色素巨噬細胞、堆積成塊兒的黑色素巨噬細胞中心等功能較為齊全的各類免疫細胞，說明該時期的頭腎在大麻哈魚幼魚參與免疫應答反應中發揮一定功能。此外，大麻哈魚幼魚頭腎實質中含有大量靜脈血管和血竇，內含成熟及未成熟的紅細胞，表明頭腎具有較強的造血功能。

3.2 脾臟的組織特點和功能

脾臟雖是魚類胚胎發育過程中發育最晚的免疫器官，但其卻是魚體紅細胞、中性粒細胞產生、儲存的主要場所［3］。硬骨魚類與軟骨魚類的脾臟結構差異較大，其中軟骨魚類的脾臟較大，造血功能強，實質分為界限清晰的紅髓和白髓，而硬骨魚類脾臟實質內的紅髓和白髓是混合排列的且界限模糊，兼具免疫和造血功能［26］。大麻哈魚幼魚同大部分魚類一樣，肝實質中紅髓與白髓混合排列，無明顯界限，如銀鯧［3］、鯔［24］等，不同于黃鱔（Monopterus albus）［27］等魚類脾臟實質具有界限清晰的白髓。此外，大多數魚類的脾臟外層都有一層薄的被膜，與脾臟實質內的網狀結構組成脾臟支架，被膜結締組織向實質內延伸形成脾小梁，但由于結締組織中肌纖維不發達，故脾小梁結構不明顯或沒有。本研究中放流前大麻哈魚幼魚脾臟外具有一層較薄的被膜，無明顯的脾小梁結構，與銀鯧［3］、駝背鱸［6］、鯔［24］等魚類相似，而與四指馬鲅［7］等少數具有明顯脾小梁結構的魚類不同。

大麻哈魚幼魚脾臟內中央靜脈及其周圍的動脈發達，與此同時脾臟實質中血竇較多，均含有大量成熟和未成熟的紅細胞，符合造血發育的特點，證實脾臟具有較強的造血及儲血功能。研究表明，脾臟主要通過脾臟實質內的淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞發揮免疫功能，如草魚［28］在擁擠脅迫條件下脾臟內的白細胞比容降低，許氏平鮋（Sebastes schlegeli）［29］受鹽度脅迫后脾臟中的粒細胞結構發生了明顯變化，推斷放流前大麻哈魚幼魚脾臟中大量的淋巴細胞、中性粒細胞和黑色素巨噬細胞在免疫應答反應中發揮了重要作用。此外，大麻哈魚幼魚脾臟實質中黑色素巨噬細胞較多，靜脈、血竇、紅髓等結構中均有分布，部分巨噬細胞聚集成群形成黑色素巨噬細胞中心，可為血細胞的更新代謝提供有力保障，與駝背鱸［6］、鯔［24］、條石鯛［26］等魚類相似，但與紅笛鯛［25］、巖原鯉（Procypris rabaudi）［30］等魚類脾臟中無明顯的黑色素巨噬細胞中心不同，進一步證明了魚類脾臟的組織結構存在種間差異。