烏司他丁對ARDS大鼠ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路及肺泡液體清除率的影響①

李詠紅 張軼強 向 丹 張玉沛 （荊門市中醫(yī)醫(yī)院肺病科，荊門 448002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由有毒物質吸入、肺炎、藥物中毒等肺內或肺外原因引起的以彌漫性肺泡損傷為主要特點的肺組織疾病，因其高發(fā)病率及高病死率而備受關注［1-2］。ARDS 發(fā)病急、難控制、預后差，常引發(fā)多器官受累，嚴重影響患者生活質量，為避免ARDS 發(fā)展，需要及時干預治療，因此開發(fā)可保護肺組織結構的藥物對ARDS 治療具有重要指導價值［3-4］。烏司他丁是從人尿液中提取的能抑制多種酶活性的糖蛋白，具有抗炎、抗氧化等多種生理活性，近年研究指出烏司他丁可一定程度緩解肺損傷，BAO 等［5］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁對肺癌患者因放療引發(fā)的急性肺損傷具有一定治療作用；徐彥立等［6］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能有效改善ARDS 患者氧代謝、肝腎功能等，具有降低患者體內炎癥因子表達、調節(jié)免疫功能等作用，對ARDS 具有較好治療效果，但作用機制尚不明確。激活的脂氧素A4 受體（lipoxin A4 receptor，ALX）/環(huán)磷酸腺苷（cyclicosine mono‐phosphate，cAMP）/磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）/Nedd4 通路與ARDS 密切相關，主要通過調節(jié)鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）、鈉/鉀-ATP酶（Na/K-adenosine triphosphatase，Na/K-ATPase）等表達促進肺泡液體清除［7］。但關于烏司他丁對ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路影響的研究較少。本研究通過建立ARDS 大鼠模型，研究烏司他丁對肺泡清除率及ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路的影響，初步探究烏司他丁的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 45只7月齡SPF級成年健康雄性SD 大鼠，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，體質量（230±20）g，生產許可證號：SCXK（粵）2016-0002。所有大鼠均于荊門市中醫(yī)醫(yī)院動物房適應性飼養(yǎng)1周，溫度約25 ℃，相對濕度約50%，噪音低于80分貝，自然光照，自由飲食進水，每天更新飲用水及食物，每周清潔1次鼠籠及更換墊料。

1.1.2 主要試劑及儀器 烏司他丁（U873326，上海麥克林生化科技有限公司）；脂多糖（LPS，L8880）、TNF-α（SEKM-0034）、IL-6（SEKM-0007）、IFN-γ（SEKM-0031）ELISA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；HE 染色試劑盒（E607218-0200，上海生工公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（P0027、P0011，上海碧云天公司）；ENaC（ab214192）、ALX（ab181101）、p-Akt（ab8805）、cAMP（ab134901）、Nedd4（ab236512）、Na/K-ATPase（ab254025）、GAPDH（ab8245）兔抗鼠一抗、羊抗兔IgG（ab150077，Abcam 公司）；ABL90 血氣分析儀（上海雷度米特醫(yī)療設備有限公司）；PUZS-300 全自動生化分析儀（上海帝博思生物科技有限公司）；XElx800 酶標儀（美國Perkin Elmer 公司）；RM2125RTS 手動輪轉式切片機（德國Leica 公司）；SMZ745 光學顯微鏡（日本尼康公司）；Trans-Blot SD 半干轉膜儀、1659001 蛋白電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；GIS-500 凝膠成像儀（Miulab公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 45 只SD 大鼠隨機分為對照組、模型組、烏司他丁低（25 000 U/kg）、中（50 000 U/kg）、高（100 000 U/kg）劑量組，每組9 只。模型組及烏司他丁各劑量組采用暴露式氣管滴注LPS 法制備ARDS 大鼠模型：將大鼠麻醉后持仰臥位固定于約50°的斜板上，碘伏清潔大鼠頸部皮膚并切開使頸部氣管暴露，氣管滴注LPS溶液（溶于生理鹽水，3 mg/kg），翻轉大鼠使LPS 溶液在肺內均勻分布，測定大鼠動脈氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（PaO2/FiO2），大鼠出現(xiàn)呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)、口唇發(fā)紺、反應遲鈍、活力降低等癥狀，PaO2<60 mmHg，PaO2/FiO2<300時提示建模成功［8］。對照組氣管滴入等量生理鹽水，剔除建模過程中死亡或不符合標準的大鼠，并及時補充備用大鼠建模，保證每組成模大鼠數(shù)量一致。模型構建成功后開始給藥，烏司他丁各劑量組按照給藥劑量進行腹腔注射，烏司他丁用生理鹽水稀釋后使用，模型組及對照組腹腔注射等量生理鹽水［9］。

1.2.2 大鼠PaO2及PaO2/FiO2檢測 給藥結束后24 h麻醉大鼠，采用血氣針腹主動脈取血1 ml，血氣分析儀測定各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2。

1.2.3 大鼠肺組織中炎癥因子水平檢測 每組取3 只大鼠，麻醉后處死并開胸獲取右側肺組織，加入組織裂解液制備肺組織勻漿，離心，收集上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明測定TNF-α、IL-6及IFN-γ水平。

1.2.4 大鼠肺組織形態(tài)學觀察及病理學損傷評分 取1.2.3 大鼠左側肺組織，生理鹽水漂洗，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片，得到常規(guī)病理切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇處理，根據(jù)HE 染色試劑盒說明進行染色，脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。對大鼠肺組織損傷程度進行評分，肺組織形態(tài)正常記為0 分；輕度肺水腫、肺泡組織中少量粒細胞浸潤并伴有少量出血記為1分；中度肺水腫、肺泡組織中較多粒細胞浸潤、出血范圍≤25%記為2分；高度肺水腫、粒細胞浸潤明顯、出血范圍≤50%記為3分；肺水腫、粒細胞浸潤嚴重、出血范圍>50%記為4分［9］。

1.2.5 大鼠肺組織肺泡液體清除率測定 每組取3 只大鼠麻醉后處死，開胸獲取大鼠全部氣管、心臟和肺臟，以伊文思藍（0.15 mg/ml）標記的5%白蛋白等滲生理鹽水作為灌注液，經氣管導管滴入右下肺，注入氧氣使灌注液充滿肺臟，機械通氣1 h 后抽取右下肺液體，酶標儀測定液體吸光度值，并計算肺泡液體清除率（%）=（1?Ci/Cf）×100%，其中Ci 為灌注液注入前濃度，Cf為吸出后濃度［10］。

1.2.6 大鼠肺組織ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路相關蛋白表達檢測 每組取3只大鼠麻醉后處死并開胸獲取右側肺組織，采用蛋白提取試劑盒提取肺組織蛋白，BCA 試劑盒測定肺組織組織蛋白濃度，將上述待測樣品加熱變性后各取20 μl 經SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉至硝酸纖維膜，TBST 洗滌后置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，加入ALX、ENaC、p-Akt、cAMP、Nedd4、Na/K-ATPase、GAPDH（1∶1 000）兔抗鼠一抗4 ℃過夜，TBST 漂洗3 次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌，增強化學發(fā)光法顯色，凝膠成像儀觀察并拍照，Image J 軟件分析各組大鼠肺組織中ALX、ENaC、p-Akt、cAMP、Nedd4、Na/K-ATPase蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠PaO2及PaO2/FiO2分析 與對照組相比，模型組大鼠PaO2及PaO2/FiO2值均顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組PaO2及PaO2/FiO2呈升高趨勢（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表1）。

表1 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2（±s，n=9）Tab.1 PaO2 and PaO2/FiO2 of rats in each group（±s，n=9）

表1 各組大鼠PaO2及PaO2/FiO2（±s，n=9）Tab.1 PaO2 and PaO2/FiO2 of rats in each group（±s，n=9）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

PaO2/FiO2 461.24±14.01 230.07±11.061）296.81±12.361）2）368.29±12.951）2）3）429.93±13.071）2）3）4）Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose PaO2/mmHg 92.13±5.01 50.06±2.341）57.37±3.721）2）68.09±4.481）2）3）81.86±5.571）2）3）4）

2.2 各組大鼠肺組織病理學觀察及肺損傷評分對照組大鼠肺組織結構完整且清晰，肺泡結構正常且分布均勻；模型組大鼠肺組織結構損傷嚴重，大量炎癥細胞浸潤，可見大量肺充血，肺泡間隔變厚且呈塌陷狀態(tài)，肺損傷評分較高；與模型組相比，烏司他丁各劑量組肺組織損傷程度明顯減輕，肺泡結構得到一定恢復，肺損傷評分逐漸降低，其中高劑量組肺損傷程度最輕（圖1、表2）。

表2 各組大鼠肺損傷評分（±s，n=3）Tab.2 Lung injury score of rats in each group（±s，n=3）

表2 各組大鼠肺損傷評分（±s，n=3）Tab.2 Lung injury score of rats in each group（±s，n=3）

Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose Lung injury score/point 030000 100001 200012 300120 403200

圖1 各組大鼠肺組織病理學觀察（×200）Fig.1 Pathological observation of lung tissue of rats in each group（×200）

2.3 各組大鼠肺組織炎癥因子表達 與對照組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6、IFN-γ 表達顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組TNF-α、IL-6、IFN-γ 表達降低（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表3）。

表3 各組大鼠肺組織炎癥因子表達比較（±s，n=3，pg/ml）Tab.3 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissue of rats in each group（±s，n=3，pg/ml）

表3 各組大鼠肺組織炎癥因子表達比較（±s，n=3，pg/ml）Tab.3 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissue of rats in each group（±s，n=3，pg/ml）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

IFN-γ 43.17±2.17 76.94±3.231）69.55±3.141）2）60.03±3.061）2）3）51.28±2.381）2）3）4）Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose TNF-α 51.64±4.08 138.29±9.241）117.60±8.651）2）95.42±6.911）2）3）73.19±4.311）2）3）4）IL-6 211.68±6.28 362.11±10.801）323.04±10.611）2）267.29±10.061）2）3）231.38±9.561）2）3）4）

2.4 各組大鼠肺組織肺泡液體清除率比較 與對照組相比，模型組大鼠肺泡液體清除率顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組肺泡液體清除率升高（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表4）。

表4 各組大鼠肺組織肺泡液體清除率比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of pulmonary alveolar fluid clearance rate of rats in each group（±s，n=3）

表4 各組大鼠肺組織肺泡液體清除率比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of pulmonary alveolar fluid clearance rate of rats in each group（±s，n=3）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

Alveolar fluid clearance rate/%21.06±2.51 4.59±0.641）6.94±0.931）2）10.60±1.211）2）3）14.22±1.351）2）3）4）Groups Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose

2.5 各組大鼠ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路相關蛋白表達 與對照組相比，模型組大鼠ALX、cAMP、p-Akt、ENaC、Na/K-ATPase 蛋白表達顯著降低（P<0.05），Nedd4 蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，烏司他丁各劑量組ALX、cAMP、p-Akt、ENaC、Na/K-ATPase 蛋白表達顯著升高（P<0.05），Nedd4 蛋白表達顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)（表5、圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織中ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路相關蛋白表達Fig.2 Expressions of ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 pathway related proteins in lung tissue of rats in each group

表5 各組大鼠肺組織ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路相關蛋白表達比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression of ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 pathway in lung tissue of rats in each group（±s，n=3）

表5 各組大鼠肺組織ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路相關蛋白表達比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression of ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 pathway in lung tissue of rats in each group（±s，n=3）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group；3）P<0.05 vs ulinastatin low dose group；4）P<0.05 vs ulinastatin medium dose group.

Na/K-ATPase/GAPDH 1.39±0.11 0.24±0.021）0.39±0.041）2）0.75±0.061）2）3）1.11±0.091）2）3）4）Groups ALX/GAPDH cAMP/GAPDH p-Akt/Akt Nedd4/GAPDH ENaC/GAPDH Control Model Ulinastatin low dose Ulinastatin medium dose Ulinastatin high dose 1.03±0.09 0.20±0.031）0.41±0.031）2）0.62±0.051）2）3）0.84±0.061）2）3）4）1.15±0.16 0.19±0.031）0.30±0.061）2）0.47±0.081）2）3）0.82±0.101）2）3）4）1.50±0.17 0.37±0.031）0.52±0.071）2）0.68±0.061）2）3）1.13±0.121）2）3）4）0.97±0.08 1.84±0.131）1.57±0.101）2）1.35±0.091）2）3）1.17±0.061）2）3）4）1.27±0.10 0.11±0.011）0.28±0.031）2）0.57±0.051）2）3）0.98±0.091）2）3）4）

3 討論

ARDS 是臨床常見呼吸類危重性疾病之一，具有呼吸窘迫、口唇發(fā)紺等臨床癥狀，以肺部炎癥、低氧血癥等為主要特征，常導致進行性、急性缺氧呼吸衰竭，病死率較高，因此建立穩(wěn)定有效的動物模型對研究ARDS發(fā)病機制及治療具有重要意義［11-12］。LPS 可顯著誘導肺組織病理學異常，促進肺組織中炎癥因子表達，腹腔注射LPS 可成功構建ARDS 模型［13］。HUANG 等［14］采用LPS 誘導大鼠ARDS 模型，結果顯示模型組大鼠肺組織損傷嚴重，體內TNF-α、IL-1β 等炎癥因子表達顯著升高。本研究采用暴露式氣管滴注LPS 構建大鼠ARDS 模型，結果顯示模型組大鼠PaO2<60 mmHg、PaO2/FiO2<300，提示大鼠ARDS 模型構建成功，HE 染色結果顯示ARDS 大鼠肺組織及肺泡結構損傷嚴重，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，且肺組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ 等炎癥因子水平顯著升高，進一步提示ARDS大鼠模型構建成功。

ARDS 發(fā)病速度快，若不及時治療，炎癥細胞、液體、蛋白等會滲入肺內，造成肺內炎癥細胞浸潤、肺泡中水腫液積累等，導致氧運轉障礙、肺部功能障礙等，嚴重危害患者生命健康，盡管目前醫(yī)療水平顯著提高，但尚無治療ARDS 的有效藥物，因此開發(fā)具有抗炎及保護肺部功能的新型藥物對ARDS 臨床治療具有重要意義［15］。烏司他丁具有抑制炎癥因子釋放、緩解急性肺損傷作用，對維持肺功能具有一定積極作用［16］。張利鵬等［17］研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁對膿毒癥性ARDS 大鼠具有一定治療作用，可通過抑制機體炎癥反應增加肺表面活性物質發(fā)揮肺保護作用。多項研究表明烏司他丁對ARDS 及急性肺損傷療效較好，可顯著提高ARDS 患者PaO2及PaO2/FiO2并縮短ARDS康復時間［18-19］。本研究顯示，烏司他丁治療的大鼠血氣分析指標（PaO2及PaO2/FiO2）顯著升高，肺組織、肺泡損傷得到一定緩解，肺組織炎癥因子水平顯著降低，肺泡液體清除率顯著升高，且呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最優(yōu)，提示烏司他丁具有顯著緩解ARDS 大鼠肺部炎癥反應、促進受損肺功能恢復作用，但作用機制尚未闡明。

ENaC、Na/K-ATPase是肺部液體清除的動力，對維持肺泡內液體轉運具有重要意義，二者主要通過轉運Na+清除肺泡內液體，ENaC 可將Na+轉運至肺泡上皮細胞，肺泡內積液隨著Na+進入上皮細胞ENaC 通道，位于基底膜的Na/K-ATPase 可將Na+轉移至肺間質，從而清除肺泡內液體，而ENaC、Na/KATPase 表達降低可導致肺部組織水腫，引發(fā)肺部疾病［20］。多項研究表明ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路與肺部組織中ENaC、Na/K-ATPase 表達、肺泡液體清除密切相關［21-22］。ZHANG 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抑制ALX/PI3K/Nedd4 通路可下調cAMP、ENaC、Na/KATPase 表達，抑制肺泡液體清除，肺泡內積液增多，進而加劇急性肺損傷大鼠肺功能障礙。ALX 是介導細胞特異性信號的G 蛋白偶聯(lián)受體，cAMP 是將信號由細胞外轉化到細胞內的第二信使，二者對調節(jié)肺泡內液體清除能力具有重要作用，cAMP 具有激活PI3K、引起Akt 磷酸化作用，并參與ENaC 激活與分布［23］。Nedd4 是一種泛素化蛋白，是負調控ENaC 的重要蛋白之一，Akt 磷酸化可減少Nedd4 對ENaC 的抑制作用，進而增加Na+重吸收，張俊麗［24］研究發(fā)現(xiàn)激活ALX/PI3K/Nedd4 信號通路可提高大鼠體內ENaC、Na/K-ATPase 表達及肺泡液體清除率，進而減輕肺損傷。本研究顯示，與模型組相比，經烏司他丁治療的大鼠肺組織ALX、cAMP、p-Akt、ENaC、Na/K-ATPase 表達顯著升高，Nedd4 表達顯著下降，表明烏司他丁可能通過激活ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4通路發(fā)揮ARDS緩解作用。

綜上，烏司他丁可顯著緩解ARDS 大鼠肺部組織炎癥反應及提高肺部液體清除能力，可能與激活ALX/cAMP/p-Akt/Nedd4 通路有關，但ARDS 發(fā)病機制復雜且烏司他丁作用機制復雜，本研究僅初步探究烏司他丁緩解ARDS 肺損傷的可能作用機制，未采用相關通路抑制劑或激活劑進行對比實驗，是本研究的不足之處，仍需進一步研究。