IL-33穩定沉默后通過削弱AKT磷酸化抑制間充質干細胞增殖①

高建華 葉小磊 郭瑩葉 方義湖 （江西醫學高等專科學校基礎醫學部，上饒 334000）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來源于發育早期的中胚層，具有向多種組織細胞分化和再生的能力。MSCs來源廣泛，可以通過多種途徑獲得，如人自體脂肪、牙髓、骨髓、臍帶、羊膜及胎盤等［1］。目前MSCs 研究主要集中在其多向分化能力和免疫調節方面，研究表明MSCs 對T 細胞的增殖、分化有直接抑制作用，MSCs 也可通過抑制樹突狀細胞的分化和成熟，從而間接抑制T 細胞的增殖和效應T 細胞亞群的分化［2］；1995 年MSCs 首次應用于臨床研究，2012 年首個MSCs 產品獲得加拿大FDA 批準上市，用于治療對免疫抑制劑不敏感的重癥急性移植物抗宿主疾病（graft-versus-host-disease，GVHD）患者，結果證實同種異源的MSCs 用于治療GVHD具有較好的安全性和有效性［3］。

目前MSCs 的免疫調節機制尚不明確，但普遍認為MSCs 通過細胞間的相互接觸和分泌一些可溶性因子來發揮免疫抑制作用。IL-33 是近年來新發現的細胞因子，在包括過敏性疾病（哮喘）、自身免疫性疾病（類風濕關節炎）、心血管疾病（心力衰竭）和神經退行性疾病（阿爾茨海默病）等多種疾病中發揮重要的免疫調節作用［4］。IL-33 隸屬于IL-1 家族（interleukin-1 family，IL-1F），通常由受損或壞死的屏障細胞（內皮細胞和上皮細胞）釋放，在與外界接觸的黏膜組織如呼吸道、消化道等有較高的表達量，充當免疫示警信號［5］；在炎癥刺激時，IL-33 在這些屏障細胞中表達上調，通過結合另外一些細胞因子如IL-25、胸腺基質淋巴蛋白參與免疫應答調節，在先天免疫、炎癥和過敏反應中發揮重要作用［6-8］。研究發現，在人臍帶中存在高水平的IL-33，但其功能不明［6］。本研究通過分離培養臍帶來源的MSCs，檢測IL-33 表達水平，并使用慢病毒shRNA 基因沉默技術，穩定下調IL-33在MSCs中的表達來探討IL-33對MSCs增殖和抗凋亡生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 MSCs 購自浙江如耀生物科技有限公司，來自人類臍帶分離物；MSCs 培養基來自美國Stem cell 公司（Lonza，貨號：12-725F）；胎牛血清來自美國HyClone 公司；轉染試劑X-treme GENETMHP購自Roche 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司；TRIzol 購自美國Life Technolo‐gies 公司；cDNA 合成試劑盒購自美國Fermentas 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）購自美國Sigma 公司；PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；流式細胞儀為美國ABI attune 產品；抗人IL-33、β-actin、AKT以及AKT磷酸化抗體形式（Ser473）抗體、Caspase-3 Antibody、Cleaved Cas‐pase-3、Bcl-2、Bax、HRP 標記羊抗兔二抗均為美國Cell signaling technology 產品；IL-33重組蛋白購自上海近岸生物科技有限公司；血清替代物購自上海恒斐生物科技有限公司（Pall，貨號：15950-017）；DMEM 培養基購自上海源培生物科技有限公司；293T細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 設計 查閱NCBI 網站，獲取IL-33的mRNA 序列，再應用shRNA 在線軟件設計shRNA特異性序列，見表1。同時采用與IL-33 mRNA 沒有同源性的shRNA 作為對照（sh Scarmble），委托蘇州金唯智公司進行目標序列的合成。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.2 細胞培養 MSCs 培養在37℃、含5%CO2飽和濕度的環境中，使用含有血清替代物、氨芐青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）的MSCs專用培養基；每天觀察細胞的生長狀況，當細胞生長開始出現接觸層疊時按1∶3 的比例進行傳代；用含有10%胎牛血清和青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養基培養293T細胞，其傳代與復蘇方法跟MSCs培養相似。

1.2.3 RT-PCR 用RT-PCR 檢測IL-33 mRNA 在不同細胞系的表達量。提取各組細胞總RNA 后，用逆轉錄酶MMLV獲取mRNA的cDNA。IL-33引物設計以及反應體系如下：IL-33 引物為hIL33-F：5'-

TGTGGAGTGCTTTGCCTTTG-3'，hIL33-R：5'-CAT‐CAACACCGTCACCTGATTC-3'；以GAPDH 基因作為內參，各組cDNA作為模板，每個樣品做3個重復。反應體系為：500 ng 模板cDNA，各0.2 μl 正反向引物，12.5 μl 熒光定量PCR MasterMix，ddH2O 補足至25 μl，35 個循環后，72 ℃延伸10 min，以GAPDH 為內參，2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量。

1.2.4 免疫印跡法 從培養箱中取出細胞，吸取培養基，將培養皿置于冰上，用預冷的PBS沖洗細胞2次，吸出剩余的PBS，在冰上用RIPA裂解液裂解細胞，然后用細胞刮刮下細胞，吹打裂解物以破壞DNA。取3 μl 進行BCA 定量，剩余樣本中添加上樣緩沖液后，95 ℃孵育5～10 min 變性，儲存于?20℃冰箱中。準備10%SDS-PAGE 凝膠，每孔加入40 μg 蛋白，電泳分離后，轉移到PVDF 膜上，封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，再加入β-actin 內參抗體并在室溫下孵育1 h，用TBST 洗滌3 次，棄掉TBST；加入二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次，棄掉TBST，在蛋白成像儀中顯影定量。

1.2.5 IL-33 shRNA 載體構建 用限制性內切酶Age Ⅰ和EcoR Ⅰ在37 ℃下酶切載體pLKO-GFPTRC 1 h；將其與退火后的shRNA 相混合，22 ℃T4連接酶連接3 h，再加入感受態細胞中進行熱擊轉化，挑選出單克隆菌群，37 ℃300 r/min 振蕩培養過夜，提取菌液質粒，并測定其純度；用核酸內切酶XhoⅠ37 ℃下酶切空載體和IL-33 shRNA 載體1 h，取4 μl 酶切產物進行電泳檢測，連接成功的質粒送蘇州金唯智公司測序驗證。用含10%的胎牛血清、氨芐青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）雙抗的DMEM 培養基培養293T細胞，使用0.25%胰酶消化傳代。實驗前2 h，將DMEM 培養基換成MEM 培養液；將2.5 μg IL-33 shRNA 載體、pCMV-dR8.91 和pCMV-VSV-G 均勻混合，加入10 μl X-treme GENE HP DNA 轉染試劑，sh Scarmble組和GFP組設為對照，室溫下靜置20 min。將轉染復合物培養24～48 h 后，收集上清液，并將其加入MSCs培養液中，用1 μg/ml的嘌呤霉素對細胞進行壓力篩選，免疫印跡檢測IL-33 在shIL-33 組、sh Scarmble 組和GFP 對照組中的表達水平。

1.2.6 細胞生長曲線 選取3 組對數生長期的MSCs 細胞接種于96 孔板中，培養箱孵育過夜，待細胞單層鋪滿孔底后，使用MTT 法進行細胞檢測，連續檢測6 d，并繪制細胞生長曲線。

1.2.7 細胞凋亡檢測 用流式細胞儀對MSCs 特征性表達分子和凋亡情況進行檢測。收集正常MSCs，分別用不同的熒光抗體標記檢測MSCs 特征性蛋白的表達水平。收集shIL-33 和sh Scramble 的MSCs，當細胞的覆蓋率達70%～80%時，用胰酶進行消化。2 000 r/min 離心5 min，棄上清液，稀釋細胞濃度至3×105個/ml。PBS 洗滌2 次后，用400 μl緩沖液重懸細胞。加入Annexin V FITC 染液5 μl，室溫孵育10 min，再加入PI 染液5 μl，4 ℃避光孵育30 min，用流式細胞儀進行樣品分析。

1.2.8 外源性IL-33對shIL-33 MSCs細胞凋亡的影響 在shIL-33 組中補充重組蛋白IL-33，終濃度為60 pg/ml，5 d 后，采用1.2.7 的方法檢測細胞凋亡率變化，用細胞計數方法結合臺盼藍染色，檢測細胞增殖相對水平變化。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析，計量數據用±s表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較用ANOVA 檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光標記抗體結合流式細胞術對培養的MSCs進行表型分析 如圖1 所示，MSCs 在鏡下形態均一，背景干凈，培養過程中增殖速度穩定，生長狀態良好。采用熒光標記抗體結合流式細胞術對培養的MSCs 進行表型分析，結果如圖1B 所示，CD29 以及CD105 指標均為陽性，所占比例分別為75%和80%，CD34、CD45以及HLA-DR均為陰性，提示所培養的MSCs純度較高，可用于后續的研究。

圖1 MSCs形態圖及流式細胞儀檢測MSCs純度Fig.1 Morphology of MSCs and evaluation purity of MSCs by flow cytometry

2.2 IL-33 在MSCs 中的表達水平 通過RT-PCR對實驗室常用的幾個細胞株進行IL-33 mRNA 表達水平檢測，如圖2 所示，IL-33 在MSCs 中為高表達，顯著高于其他幾個細胞株，包括H1299（人肺癌細胞），HUVEC（人臍靜脈內皮細胞）以及THP-1 細胞（人單核巨噬細胞）。

圖2 在不同細胞株中IL-33 mRNA的相對表達水平Fig.2 Relative expression of IL-33 mRNA in different cells

隨后構建3 個用于慢病毒包裝的shRNA 載體，得到大量的陽性克隆如圖3A 所示。得到克隆進行菌液的測序分析，結果如圖3B 所示，提示構建的shRNA序列與設計的序列完全一致。

圖3 IL-33 shRNA沉默載體構建Fig.3 Construction of IL-33 shRNA silencing vectors

2.3 IL-33 包裝慢病毒的感染效率 將IL-33 特異性基因shRNA 克隆到pLKO 質粒載體中，再用慢病毒進行包裝，48 h后，收集培養上清液中的慢病毒并用于感染靶細胞，將pLKO-sh Scramble 載體用作對照，如圖4 所示，從熒光結果來看，細胞的感染率約為90%。

圖4 MSCs 感染shIL-33 慢病毒后在顯微鏡下的明場（BF）和綠色熒光（FL）圖像Fig.4 Brightfield （BF） and green fluorescence （FL）images of MSCs after infection with shIL-33 lentivirus under a microscope

2.4 IL-33 穩定沉默對蛋白表達的影響 免疫印跡結果顯示，shIL-33 組與pLKO 組相比，IL-33 表達顯著降低。如圖5 所示，設計的shRNA 都不同程度上沉默IL-33 表達，其中shRNA3 沉默效果最好，其敲除效率可以達到95%，說明通過慢病毒技術構建的shRNA 載體能高效抑制MSCs 中IL-33 的表達，選擇shRNA3感染的細胞用于后續實驗。

圖5 免疫印跡檢測慢病毒感染MSCs后IL-33的蛋白表達Fig.5 Expression level of IL-33 in infected-MSCs was detected by immunoblotting

2.5 IL-33 穩定沉默對MSCs 增殖能力的影響 通過MTT法繪制細胞生長曲線來評估沉默IL-33對MSCs增殖的影響，結果如圖6A 所示，與pLKO 組相比，IL-33 干擾后的MSCs 的增殖速度在第4 天和第5 天顯著變慢，差異具有統計學意義（P<0.05），在第6天時與pLKO 組水平持平。采用免疫印跡探究Ki-76 水平的變化，結果如圖6B 所示，與pLKO 組相比，IL-33干擾后的MSCs 的Ki-76 水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖6 沉默IL-33對MSCs增殖影響Fig.6 Effects of IL-33 silencing on MSCs proliferation

2.6 IL-33 穩定沉默對MSCs 凋亡的影響 采用Annexin V/PI 試劑盒檢測細胞凋亡，結果如圖7 所示，shIL-33組中的凋亡水平顯著高于pLKO組，差異有統計學意義（P<0.01）。

圖7 沉默IL-33對MSCs凋亡的影響Fig.7 Effect of silencing IL-33 on apoptosis of MSCs

2.7 IL-33 穩定沉默對MSCs 凋亡相關蛋白的影響 采用免疫印跡探究IL-33 穩定沉默MSCs 后對凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-3的影響。結果如圖8 所示，shIL-33 組中的促凋亡蛋白Bax 和Cleaved Caspase-3 水平高于pLKO 組，而抗凋亡相關基因蛋白Bcl-2 低于pLKO 組，差異有統計學意義（P<0.01）。

圖8 沉默IL-33對MSCs中凋亡蛋白的影響Fig.8 Effect of silencing IL-33 on apoptosis protein in MSCs

2.8 IL-33穩定沉默對MSCs增殖相關蛋白的影響

采用免疫印跡進行增殖相關蛋白AKT 及其磷酸化形式分析，結果如圖9 所示，AKT 磷酸化在沉默IL-33 后被顯著抑制，給予重組IL-33 蛋白（rhIL-33）后，磷酸化ser473 的水平可以恢復，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖9 IL-33沉默對總AKT和AKT磷酸化的影響Fig.9 Effect of IL-33 silencing on total AKT and AKT phosphorylation

2.9 補充IL-33 對MSCs 增殖和凋亡的影響 補充rhIL-33，檢測其對MSCs 增殖和凋亡的影響，結果如圖10 所示，MSCs 的相對增殖速度在補充rhIL-33 后得到恢復，相對凋亡水平顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。

圖10 補充rhIL-33對MSCs增殖和凋亡的影響Fig.10 Effect of rhIL-33 supplementation on prolifera?tion and apoptosis in MSCs

3 討論

MCSs作為免疫系統“安全信號”的來源，具有較好的免疫抑制效應，已有臨床研究開始使用MSCs治療移植物抗宿主病、克羅恩病和骨關節炎等免疫介導的疾病，然而對MSCs 免疫調節機制尚未完全闡明。初步研究顯示，MSCs不僅可對多種免疫細胞產生直接的作用還可以分泌多種免疫調節因子影響免疫功能，如IL-10、IL-6、TGF-β、CCL-2、CCL-5、IDO、VEGF、ICAM、PGE2 等［7］。IL-33 是細胞因子IL-1 超家族的新成員，主要由上皮細胞和內皮細胞等基質細胞表達，在促炎刺激后其表達上調，IL-33既可以作為傳統的細胞因子，也可以作為調節基因轉錄的核因子［8］。本研究檢測了臍帶來源的MSCs中IL-33 表達水平，發現IL-33 在基因和蛋白水平均存在高表達，不需要通過炎癥因子刺激。也有文獻顯示，IL-33/ST2 信號通路在健康妊娠和胚胎發育中發揮作用，表達下降可導致子癇前期孕婦滋養層細胞功能異常［9］。這說明IL-33在臍帶來源MSCs天然分泌，并對妊娠期間相關細胞正常生理功能的維持具有重要意義。

早期研究認為，IL-33主要作為炎癥警告蛋白在炎癥中發揮重要作用，但近年研究發現IL-33 還與細胞增殖、凋亡息息相關，IL-33 可以通過抑制cas‐pase-3的裂解，減少細胞凋亡，從而促進心肌細胞的存活［10］。CHEN 等［11］發現通過注射高表達IL-33 的MSCs可明顯改善心肌梗死大鼠的心功能，減輕炎癥反應，表明了IL-33 在心臟病中的心臟保護作用。再者，IL-33還可以促進小鼠肥大細胞的增殖［12］。在干細胞相關研究中也發現，IL-33可以影響部分干細胞的存活、增殖和分化，IL-33 可顯著促進骨髓中的骨髓造血干細胞的生成和髓樣細胞遷移［13］。IL-33可刺激牙髓干細胞增殖和克隆形成［14］。為進一步了解IL-33 對MSCs 增殖和凋亡的影響，本課題組使用了慢病毒載體來穩定沉默細胞中IL-33 的表達，結果顯示，IL-33穩定沉默后細胞的增殖速度明顯降低，凋亡率明顯增加。而補充外源性IL-33 重組蛋白后則恢復細胞的增殖能力。這些結果提示，IL-33對MSCs 增殖有明顯的促進作用，并可使細胞具備較強的存活和抗凋亡能力。

IL-33 通過與ST2 結合后，可誘導ERK1/2、JNK、p38 和PI3K/AKT 等信號通路中相關蛋白的磷酸化，繼而導致前致炎因子釋放、信號轉導異常，與多種急、慢性炎癥相關疾病的發病有關。研究表明，IL-33 可以通過影響巨噬細胞極化提高MSCs 的免疫調節能力，其潛在機制可能是IL-33 通過誘導AKT 磷酸化調節細胞周期，減少MSCs 的凋亡［15-16］。AKT 也稱為蛋白激素酶B，是一類絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，對于細胞存活和凋亡至關重要［17］。在干細胞的研究中發現，AKT 的活化可通過抑制GSK3β 抑制多能干細胞的凋亡，通過小分子抑制劑抑制AKT活性后可誘導干細胞凋亡的發生［18］。同時有研究顯示，IL-33 可以通過ST2 非依賴性途徑顯著抑制GSK3β 的活化，從而活化PI3K/AKT 通路［19］。因此，本研究進一步檢測了AKT 及其磷酸化水平，結果發現，MSCs 中沉默IL-33 后，AKT 磷酸化（ser473）水平也明顯下調，而給予shIL-33 后，AKT 磷酸化水平可以恢復，該結果表明，IL-33 在穩定AKT 磷酸化水平中可能發揮重要作用，AKT通路的活化可能是IL-33調節MSCs 增殖、凋亡的關鍵機制。同時，最新的研究表明，在促炎條件下，IL-33 表達水平的變化被認為是預測器官損傷和異體器官移植的生物標志［20］。另有研究表明，通過一定的遞送手段，傳遞或阻斷IL-33是一種有效的治療策略，可以維持免疫系統的穩態，預防感染性和炎癥性疾病［21］。鑒于本研究發現IL-33 能夠調節MSCs 的增殖和凋亡，猜測IL-33可能對MSCs 介導的組織愈合、器官移植等具有重要的調節作用，繼續深入探討其在MSCs 中的功能和機制，將是下一步研究的重點。

綜上所述，本研究使用慢病毒技術穩定沉默IL-33在MSCs中的表達水平，發現MSCs的增殖能力明顯減弱，細胞凋亡比例明顯增高，而外源性重組IL-33 則能恢復細胞增殖；IL-33 沉默后AKT 磷酸化水平顯著下調，說明IL-33 可能與MSCs 增殖、凋亡有關，并通過調節AKT磷酸化來發揮其作用。