circ_0001955 靶向miR-1243 調控肝癌BEL-7402 細胞增殖、凋亡及EMT 的機制研究

曹 穎 曹 偉 賈延偉 王冰瑩 （蘇州大學附屬第二醫院檢驗科，蘇州 215100）

肝癌是全球范圍內最常見的致命惡性腫瘤，晚期患者預后不良。選擇新的肝癌治療方式，以改善患者預后是必要的［1］。分子靶向藥物已應用于肝癌的臨床治療中，但部分藥物療效不理想，需尋找新的靶點以開發新的靶向藥物［2］。環狀RNA（circRNA）是一種新的非編碼RNA，涉及多種疾病的發生和發展，可作為新型有前景的人類腫瘤的生物標志物或治療靶標［3］。研究報道肝癌腫瘤組織中的circ_0001955 水平升高，敲除circ_0001955 在體內外抑制了肝癌腫瘤的生長［4］。circ_0001955 可通過調控miR-145-5p 影響大腸癌進展［5］。然而circ_0001955對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響及機制尚未完全清楚。研究報道miR-1243 通過抑制胰腺癌的EMT 來增加其對吉西他濱的敏感性，miR-1243 可能是新型的化學治療靶標，可以作為胰腺癌的生物標志物［6］。miR-1243在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達下調，敲低miR-1243 后促進TPC-1 細胞的增殖和遷移能力［7］。而miR-1243 對肝癌細胞增殖、凋亡及EMT 的影響尚不清楚。本實驗旨在研究circ_0001955是否通過調控miR-1243影響肝癌細胞的增殖、凋亡及EMT。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取蘇州大學附屬第二醫院2016年1月至2020年6月期間收治的20例肝癌患者，通過手術取其癌組織及癌旁組織，本研究獲蘇州大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準。納入標準：①與《原發性肝癌規范化病理診斷指南（2015 版）》中原發性肝癌診斷標準相符，經病理學確診；②年齡≥18 歲，首次發病；③所有患者均知情且同意。排除標準：①有心、肺、腎等重要器官疾病；②伴其他部位惡性腫瘤者；③入組前1 周接受放化療、介入治療、分子靶向藥物治療等抗腫瘤治療。20 例患者中男14 例，女6 例；年齡28～78 歲，平均55 歲；肝癌TNM 臨床分期標準：Ⅰ+Ⅱ期15例，Ⅲ+Ⅳ期5例；病理學分級：Ⅰ/Ⅱ：12例，Ⅲ/Ⅳ期8例。

1.1.2 材料 肝癌細胞株BEL-7402（上海北諾生物科技有限公司）；RPMI1640 培養基（上海高創化學科技有限公司）；熒光定量試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；MTT 試劑盒（上海美軒生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（上海超研生物科技有限公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（艾美捷科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（武漢純度生物科技有限公司）。circ_0001955 干擾質粒及陰性對照、miR-1243 模擬物，miR-1243 inhibitor 及其陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 肝癌細胞株BEL-7402接種在RPMI1640 培養基中進行常規培養，取對數生長期細胞，將circ_0001955 干擾質粒及陰性對照、miR-1243 模擬物及其陰性對照用50 μl 無血清培養液稀釋，輕輕混勻；同時取同樣量的培養液稀釋轉染試劑，室溫靜置5 min；然后將上述兩種溶液混勻，靜置20 min 后加入到提前培養好的BEL-7402 細胞中，混勻，孵育6 h 后更換新的培養液繼續培養，將其分別記為si-NC 組、si-circ_0001955 組、miR-NC組、miR-1243 組；將circ_0001955 干擾質粒分別與miR-1243 inhibitor 及其陰性對照按上述方法轉染至BEL-7402 細胞中，記為si-circ_0001955+anti-miRNC 組、si-circ_0001955+anti-miR-1243 組。si-circ_0001955 序列為：5'-TTCGAAATCAGGTGAAGGT-3'；miR-1243 mimic：5'-AACTGGATCAATATAGGAGTG-3'；miR-1243 inhibitor：5'-GGCATTCACCGCGT‐GCCTTA-3'。

1.2.2 RT-qPCR 檢測circ_0001955 和miR-1243 的表達水平 提取癌組織、癌旁組織及細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環；融解曲線：95 ℃15 s，60 ℃15 s，95 ℃15 s。相對表達量用2?ΔΔCt法計算，其中circ_0001955 和miR-1243 分別以GAPDH和U6為內參。circ_0001955正向引物序列：5'-GGTGCATCTGCAATAACTCG-3'，反向引物序列：5'-ATTTCCCACATGGTCCAAAG-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'，反向引物序列：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'；miR-1243 正向引物序列：5'-AACTGGATCAATTATAG‐GAGTG-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCGTGTCGTG‐GAGT-3'；U6 正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAG‐CACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖 取各組對數生長期細胞，以1×104個/孔接種細胞于96 孔板，培養48 h 后每孔分別加入MTT 溶液20 μl，在培養箱中繼續孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩反應10 min 使沉淀溶解，用酶標儀檢測490 nm 處吸光度（OD）值。增殖抑制率（%）=（1?OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養48 h的各組細胞，用預冷的PBS 漂洗2 次，與500 μl 的結合緩沖液混勻，按試劑盒說明加入Annexin V-FITC和PI 試劑各5 μl，混勻，避光孵育10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率即為AnnexinV+PI-和AnnexinV+PI+2 個象限的細胞數之和占總細胞數的比例。

1.2.5 Western blot 法檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白，定量后取50 μl 進行SDS-PAGE，經電轉將蛋白轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌3次，每次5 min；再加入二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3 次，每次10 min，曝光顯影，再浸入定影液，晾干后用Quantity One 凝膠軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0001955 和miR-1243 的靶向調控 構建野生型和突變型circ_0001955 的熒光素酶表達載體WT-circ_0001955 和MUT-circ_0001955，將其分別與miR-NC 和miR-1243 共轉染至細胞BEL-7402 中；按試劑盒說明檢測BEL-7402 細胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，以二者比值作為相對熒光素酶活性。將circ_0001955 過表達載體、circ_0001955 抑制表達載體及其陰性對照轉染至BEL-7402 細胞中，按1.2.2中方法檢測miR-1243表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_0001955 和miR-1243 在肝癌組織中的表達 采用RT-qPCR 方法比較了20 例肝癌和癌旁組織中circ_0001955 和miR-1243 的表達水平，結果顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中circ_0001955表達水平升高，miR-1243表達水平降低（P<0.05，表1）。

表1 circ_0001955 和miR-1243 在肝癌組織中的表達（±s，n=20）Tab.1 Expressions of circ_0001955 and miR-1243 in liver cancer tissues（±s，n=20）

表1 circ_0001955 和miR-1243 在肝癌組織中的表達（±s，n=20）Tab.1 Expressions of circ_0001955 and miR-1243 in liver cancer tissues（±s，n=20）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P<0.05.

miR-1243 1.01±0.01 0.35±0.011）36.970 0.000 Groups Adjacent tissue Liver cancer tissue tP circ_0001955 0.98±0.02 3.67±0.011）101.800 0.000

2.2 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞增殖的影響 采用RT-qPCR 方法檢測干擾circ_0001955 效果，結果顯示，circ_0001955 表達水平降低，說明干擾成功；用MTT 法檢測細胞增殖情況，結果顯示，干擾circ_0001955后細胞增殖活力降低；用Western blot 檢測Ki-67 蛋白表達水平，結果顯示，干擾circ_0001955 后Ki-67 蛋白表達水平降低（P<0.05，圖1、表2）。

表2 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞增殖活力的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of inhibiting expression of circ_0001955 on proliferation of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

表2 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞增殖活力的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of inhibiting expression of circ_0001955 on proliferation of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Ki-67 protein 0.72±0.03 0.29±0.041）8.561 0.000 Groups si-NC si-circ_0001955 tP circ_0001955 1.03±0.03 0.36±0.031）15.620 0.000 Cell viability/%100.00±9.40 48.57±4.401）14.866 0.000

圖1 增殖相關蛋白表達Fig.1 Proliferation-related protein expression

2.3 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞凋亡的影響 采用流式細胞術檢測干擾circ_0001955肝癌細胞凋亡情況，結果顯示，BEL-7402細胞凋亡率升高；用Western blot檢測凋亡相關蛋白表達情況，結果顯示，Bcl-2 表達水平降低，Bax 表達水平升高（P<0.05，圖2、表3）。

表3 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of inhibiting expression of circ_0001955 on apoptosis of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

表3 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞凋亡的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of inhibiting expression of circ_0001955 on apoptosis of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Bax protein 0.21±0.02 0.67±0.021）19.400 0.000 Groups si-NC si-circ_0001955 tP Apoptosis rate/%6.37±0.14 24.08±0.621）28.030 0.000 Bcl-2 protein 0.62±0.03 0.19±0.011）11.390 0.000

圖2 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of inhibiting expression of circ_0001955 on apoptosis of liver cancer BEL-7402 cells

2.4 抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402 細胞EMT 的影響 Western blot 檢測EMT 相關蛋白表達情況，結果顯示，干擾circ_0001955 后肝癌BEL-7402 細胞中E-cadherin 表達水平升高，Vimentin 表達水平降低（P<0.05，圖3、表4）。

表4 circ_0001955表達對肝癌BEL-7402細胞EMT 的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of circ_0001955 expression on EMT of liv?er cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

表4 circ_0001955表達對肝癌BEL-7402細胞EMT 的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of circ_0001955 expression on EMT of liv?er cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Vimentin protein 0.68±0.03 0.27±0.021）12.960 0.000 Groups si-NC si-circ_0001955 tP E-cadherin protein 0.23±0.02 0.48±0.021）8.602 0.000

圖3 EMT相關蛋白表達Fig.3 EMT related protein expression

2.5 circ_0001955 靶向調控miR-1243 的表達（Star‐Base） StarBase 預測顯示circ_0001955 的序列中含有與miR-1243互補的核苷酸序列（圖4）。雙熒光素酶報告實驗檢測結果顯示，WT-circ_0001955 與miR-1243 共轉染后的細胞熒光素酶活性降低（P<0.05）；MUT-circ_0001955 與miR-1243 共轉染后的細胞熒光素酶活性差異無統計學意義（P>0.05，表5）。采用RT-qPCR 方法檢測抑制circ_0001955表達及過表達circ_0001955 后miR-1243 的表達水平，結果顯示，與si-NC 組比較，si-circ_0001955 組miR-1243 的表達水平升高；與pcDNA 組比較，circ_0001955組miR-1243的表達水平降低（P<0.05，表6）。

表5 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.5 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

表5 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Tab.5 Double luciferase report experiment（±s，n=9）

Note：Compare with miR-NC，1）P<0.05.

MUT-circ_0001955 1.01±0.03 1.01±0.02 0.094 0.927 Groups miR-NC miR-1243 tP WT-circ_0001955 1.03±0.02 0.43±0.031）16.580 0.000

表6 circ_0001955調控miR-1243的表達（±s，n=9）Tab.6 circ_0001955 regulates expression of miR-1243（±s，n=9）

表6 circ_0001955調控miR-1243的表達（±s，n=9）Tab.6 circ_0001955 regulates expression of miR-1243（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with pcDNA group，2）P<0.05.

miR-1243 0.98±0.08 2.68±0.221）1.02±0.07 0.43±0.052）182.641 0.000 Groups si-NC si-circ_0001955 pcDNA circ_0001955 tP

圖4 circ_0001955 序列中含有與miR-1243 互補的核苷酸序列Fig.4 Sequence of circ_0001955 contains a nucleotide se?quence complementary to miR-1243

2.6 miR-1243 過表達對肝癌BEL-7402 細胞增殖、凋亡和EMT 的影響 采用RT-qPCR 方法檢測miR-1243轉染效果，結果顯示，miR-1243表達水平升高；MTT 法檢測過表達miR-1243后細胞增殖情況，結果顯示，細胞增殖活力降低；流式細胞術檢測過表達miR-1243 后細胞凋亡情況，結果顯示，細胞凋亡率升高；用Western blot檢測蛋白表達水平，結果顯示，過表達miR-1243 后，Ki-67、Bcl-2 和Vimentin 表達水平降低，Bax 和E-cadherin 表達水平升高（P<0.05，圖5、表7）。

表7 miR-1243過表達對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡和EMT的影響（±s，n=9）Tab.7 Effects of miR-1243 overexpression on proliferation，apoptosis and EMT of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

表7 miR-1243過表達對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡和EMT的影響（±s，n=9）Tab.7 Effects of miR-1243 overexpression on proliferation，apoptosis and EMT of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Vimentin protein 0.65±0.02 0.29±0.041）7.951 0.000 Groups miR-NC miR-1243 tP miR-1243 1.02±0.02 2.90±0.071）24.540 0.000 Cell viability/%100.00±8.80 48.61±4.201）15.811 0.000 Apoptosis rate/%7.09±0.31 19.85±0.501）21.580 0.000 Ki-67 protein 0.81±0.04 0.41±0.021）8.002 0.000 Bcl-2 protein 0.56±0.02 0.24±0.011）13.260 0.000 Bax protein 0.25±0.03 0.65±0.041）8.682 0.000 E-cadherin protein 0.17±0.01 0.46±0.031）8.131 0.000

圖5 miR-1243 過表達對肝癌BEL-7402 細胞增殖、凋亡和EMT的影響Fig.5 Effects of miR-1243 overexpression on prolifera?tion，apoptosis and EMT of liver cancer BEL-7402 cells

2.7 干擾miR-1243 表達逆轉了抑制circ_0001955表達對肝癌BEL-7402 細胞增殖、凋亡和EMT 的作用 采用RT-qPCR 方法檢測轉染效果，結果顯示，miR-1243 表達水平降低；MTT 法檢測抑制circ_0001955 和miR-1243 表達后細胞增殖情況，結果顯示，細胞活力升高；流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示，與si-circ_0001955+anti-miR-NC 組比較，si-circ_0001955+anti-miR-1243 組細胞凋亡率降低；用Western blot 檢測蛋白表達水平，結果顯示，Ki-67、Bax和Vimentin表達水平升高，Bcl-2和E-cad‐herin表達水平降低（P<0.05，表8、圖6）。

表8 干擾miR-1243表達逆轉了抑制circ_0001955表達對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡和EMT的作用（±s，n=9）Tab.8 Interference of miR-1243 expression reversed effect of inhibiting circ_0001955 expression on proliferation，apopto?sis and EMT of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

表8 干擾miR-1243表達逆轉了抑制circ_0001955表達對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡和EMT的作用（±s，n=9）Tab.8 Interference of miR-1243 expression reversed effect of inhibiting circ_0001955 expression on proliferation，apopto?sis and EMT of liver cancer BEL-7402 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-circ_0001955+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Vimentin protein 0.23±0.02 0.55±0.021）13.640 0.000 Groups miR-1243 Ki-67 protein Bcl-2 protein Bax protein si-circ_0001955+anti-miR-NC si-circ_0001955+anti-miR-1243 tP 1.00±0.03 0.37±0.011）17.090 0.000 Cell viability/%48.15±5.40 61.25±0.041）7.278 0.000 Apoptosis rate/%23.67±1.37 15.63±0.561）5.434 0.000 0.30±0.03 0.66±0.031）9.074 0.000 0.56±0.03 0.49±0.031）1.899 0.000 0.22±0.01 0.37±0.021）20.125 0.000 E-cadherin protein 0.47±0.03 0.27±0.011）7.114 0.000

圖6 干擾miR-1243 表達逆轉抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡和EMT的作用Fig.6 Interference of miR-1243 expression reversed effect of inhibiting circ_0001955 expression on prolifera?tion，apoptosis and EMT of liver cancer BEL-7402 cells

3 討論

隨著現代醫學的不斷發展，靶向治療正逐漸成為肝癌治療的主要途徑之一［8］。研究表明一些circRNA 可通過調節各種生物學過程在肝癌進程中發揮致癌作用或抑制作用，被鑒定為肝癌診斷和預后的潛在生物標志物［9］。circRHOT1 在肝癌組織中上調表達，circRHOT1表達水平高的患者預后較差；且circRHOT1可促進肝癌細胞的生長和轉移［10］。肝癌組織中circSETD3 的低表達預示了預后不良，并且與患者的腫瘤較大和肝癌分化差有關，是有價值的預后生物標志物；且circSETD3 高表達通過調控miR-421 抑制了肝癌細胞的增殖［11］。以上研究表明circRNA 參與了肝癌的發生發展過程，可作為生物標志物。研究報道circ_0001955 在三陰性乳腺癌中差異表達［12］。本實驗結果顯示，肝癌組織中circ_0001955表達水平升高。此外，抑制circ_0001955表達后，肝癌細胞活力降低，Ki-67蛋白表達水平降低，BEL-7402 細胞凋亡率升高，Bcl-2 蛋白表達水平降低，Bax 蛋白表達水平升高；表明抑制circ_0001955表達可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡。且抑制circ_0001955 表達還上調了E-cadherin 蛋白表達，下調了Vimentin 蛋白表達；E-cadherin、Vimentin 是EMT 過程相關因子，因此，實驗結果還表明，抑制circ_0001955表達抑制了肝癌的EMT過程。

研究表明circRNA 可通過miRNA 及其靶基因mRNA影響肝癌的進展［13］。如circRNA-5692可通過刺激miR-328-5p 進而增強DAB2IP 的表達來抑制肝癌的發展［14］。本實驗通過StarBase 預測circ_0001955的靶向結合miRNA，結果發現circ_0001955與miR-1243 有結合位點。研究報道miR-1243 通過靶向抑制Akt1 和Akt2 的表達進而調節甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞遷移［15］。circ_0002570 通過miR-1243/血管動蛋白軸抑制高糖誘導的視網膜微血管內皮細胞的血管生成和炎癥［16］。本實驗結果顯示，肝癌組織中miR-1243 表達水平降低；過表達miR-1243 后，肝癌細胞活力降低，細胞凋亡率升高，Ki-67、Bax和Vimentin表達水平降低，Bcl-2和E-cad‐herin表達水平升高；表明過表達miR-1243可抑制肝癌細胞增殖及EMT，且促進細胞凋亡。本實驗還證實circ_0001955 靶向調控miR-1243；而干擾miR-1243 表達逆轉了抑制circ_0001955 表達對肝癌BEL-7402細胞增殖、凋亡和EMT的作用。

綜上所述，抑制circ_0001955 表達可能通過調控miR-1243 抑制肝癌BEL-7402 細胞增殖及EMT，促進細胞凋亡。