miR-221-3p 靶向FGF14 調控肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的分子機制①

李淑勤 趙樹強 鄭麗琴 （山西醫科大學汾陽學院臨床醫學系內科教研室，呂梁 032200）

肺腺癌患者中常見病理類型為轉移性肺癌，但轉移的分子機制仍未完全闡明，微小RNA（miRNA）調節基因表達可參與癌癥的發展過程，miR-576-3p通過靶向SGK1 可抑制肺腺癌細胞遷移和侵襲［1］。miR-21-5p 通過靶向SET/TAF-1α 促進肺腺癌的進展［2］。miR-145 通過靶向N-cadherin 而抑制肺腺癌細胞的侵襲和遷移［3］。miR-138-5p 通過靶向E 盒結合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）抑制肺腺癌細胞上皮-間質轉化、增殖和轉移［4］。表明miRNA 可介導肺腺癌發生及轉移過程。miR-221-3p 在非小細胞肺癌細胞中表達水平升高，并可通過靶向p27 促進非小細胞肺癌細胞生長［5］。靶基因預測顯示成纖維細胞生長因子14（fibroblast growth factor-14，FGF14）與miR-221-3p 存在結合位點，FGF14 在肺腺癌中低表達并發揮抑癌作用［6］。但miR-221-3p 是否可通過調控FGF14 的表達從而參與肺腺癌發生及發展過程尚未可知。因此，本研究主要探討miR-221-3p 對肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，探究其對FGF14的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞BEAS-2B 與人肺腺癌細胞A549、A-427、PC-9 購自美國ATCC 細胞庫；DMEM 培養基購自美國Gibco 公司；胎牛血清、Lipo‐fectamine2000、Trizol 試劑、反轉錄合成及qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；miR-inhibitor-NC、miR-221-3p inhibitor、si-NC、si-FGF14 購自廣州銳博生物科技有限公司；MTT 試劑購自美國Sigma公司；凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD 公司；兔抗人FGF14 抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、P21、Bax 抗體購自美國Santa Cruz 公司；HRP 標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 BEAS-2B、A549、A-427、PC-9 細胞常規培養，待細胞生長融合度達到80%時進行細胞傳代培養。取對數生長期PC-9 細胞（2.5×105個/ml）接種于96 孔板（100 μl/孔），分別將miR-inhibitor-NC（ACGUAUCGAUGCU）、miR-221-3p inhibitor（CGAUCGUAGCUAUCGU）、si-NC（GCUA‐GUCGAUCGUAGCU）、si-FGF14（GUAGUCGAUGCUAG）、miR-inhibitor-NC+si-NC、miR-221-3p inhibotor、si-NC、miR-221-3p inhibotor+si-FGF14 轉染至PC-9 細胞，分別記作miR-inhibitor-NC 組、miR-221-3p inhibitor 組、si-NC 組、si-FGF14 組、miR-inhibitor-NC+si-NC 組、miR-221-3p inhibotor+si-NC 組、miR-221-3p inhibotor+si-FGF14組。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞中miR-221-3p、FGF14 mRNA 的表達水平 采用Trizol 法提取BEAS-2B、A549、A-427、PC-9 細胞及各組轉染后的PC-9 細胞中總RNA，RNA 置于?80 ℃超低溫冰箱內保存。反轉錄體系：RNA 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Rand. om Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，參照試劑盒說明書配置反應體系，應用美國ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR 儀檢測miR-221-3p（內參U6）、FGF14（內參GAPDH）mRNA 相對表達量。miR-221-3p 正向引物：5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'，反向引物：5'-TGCTTATGGCAGTGTATTGTT-3'；FGF1 正向引物：5'-AGTCAG-TCGTATCGTAG-3'，反向引物：5'-CGTAGCTATGCTAGCTGAT-3'；U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；GAPDH 正向引物：5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'，反向引物：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖 取各組PC-9 細胞接種于96孔板（5×103個/孔），分別轉染24 h、48 h、72 h時向孔內加入MTT 溶液（20 μl/孔），繼續培養4 h 后棄上清，加入DMSO（150 μl/孔），室溫振蕩孵育5 min后應用酶標儀檢測各孔光密度值（OD值）。

1.2.4 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲 取各組PC-9 細胞（2.5×105個/ml）加入上室（200 μl/孔），下室加入含有胎牛血清（10%）的培養液（600 μl/孔），繼續培養24 h 后采用PBS 洗滌，然后加入多聚甲醛固定（20 min）后進行0.1%結晶紫染液染色（10 min），應用顯微鏡觀察遷移細胞數。使用預冷培養液稀釋Matrigel 基質膠后加入小室的上室（40 μl/孔），繼續培養5 h 后加入各組PC-9 細胞懸液，后續實驗步驟同上，應用顯微鏡觀察侵襲細胞數。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組PC-9 細胞加入預冷PBS 洗滌后棄上清，加入500 μl 結合緩沖液重懸細胞后分別加入Annexin V-FITC、PI，室溫振蕩孵育10 min 后應用FACS Calibur 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-221-3p 與FGF14 的靶向關系 Targetscan human 預測顯示miR-221-3p 與FGF14 存在靶向關系，分別構建野生型載體WT-FGF14 與突變型載體MUT-FGF14，分別將miR-NC、miR-221-3p mimics 與WT-FGF14、MUTFGF14 共轉染至PC-9 細胞后繼續培養24 h，收集細胞后檢測相對熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測FGF14、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、P21、Bax 蛋白表達 各組PC-9 細胞中加入RIPA 裂解液（400 μl）提取細胞總蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度后進行SDS-PAGE 電泳反應，轉膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液（1∶1 000）與二抗稀釋液（1∶2 000），滴加ECL 顯影后應用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0統計學軟件分析數據，計量資料以±s表示且均符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測肺腺癌細胞株和正常人支氣管上皮細胞中miR-221-3p 和FGF14 的表達水平 與BEAS-2B細胞比較，肺腺癌細胞A549、A-427、PC-9 中miR-221-3p 的表達水平升高（P<0.05），FGF14 mRNA 及蛋白水平降低（P<0.05），其中miR-221-3p 在肺腺癌細胞PC-9 中的表達水平相對較高，因而選用PC-9細胞進行后續研究，見圖1。

圖1 肺腺癌細胞株和正常人支氣管上皮細胞中miR-221-3p和FGF14的表達水平Fig.1 Expression levels of miR-221-3p and FGF14 in lung adenocarcinoma cell lines and normal human bronchial epithelial cells

2.2 轉染miR-221-3p inhibitor 對肺腺癌細胞PC-9增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miR-inhibitor-NC組比較，miR-221-3p inhibitor組OD值降低（P<0.05），CyclinD1 蛋白水平降低（P<0.05），P21 蛋白水平升高（P<0.05），與miR-inhibitor-NC組比較，miR-221-3p inhibitor組遷移及侵襲細胞數減少（P<0.05），MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（P<0.05）；與miR-inhibitor-NC組比較，miR-221-3p inhibitor 組凋亡率升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P<0.05），Bax 蛋白水平升高（P<0.05），見圖2。

圖2 轉染miR-221-3p inhibitor 對肺腺癌細胞PC-9 增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.2 Effects of transfection of miR-221-3p inhibitor on proliferation，migration，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cell PC-9

2.3 Targetscan human分析miR-221-3p與FGF14之間存在相互作用，且靶向負調控 Targetscan human預測顯示miR-221-3p 與FGF14 存在結合位點，見圖3A。miR-221-3p過表達可明顯降低WT-FGF14的熒光素酶活性（P<0.05），而對MUT-FGF14 的熒光素酶活性無顯著影響（P>0.05），見圖3B。與miR-in‐hibitor-NC 組比較，miR-221-3p inhibitor 組FGF14 mRNA的表達水平升高（P<0.05），見圖3C。

圖3 miR-221-3p靶向負調控FGF14的表達Fig.3 miR-221-3p targets and negatively regulates expres?sion of FGF14

2.4 沉默FGF14對肺腺癌細胞PC-9增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-FGF14 組OD值升高（P<0.05），遷移及侵襲細胞數增多（P<0.05），凋亡率降低（P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），P21、Bax 蛋白水平降低（P<0.05），見圖4。

圖4 沉默FGF14 對肺腺癌細胞PC-9 增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.4 Effects of silencing FGF14 on proliferation，migra?tion，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cell PC-9

2.5 沉默FGF14 能逆轉干擾miR-221-3p 對肺腺癌細胞PC-9 增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miRinhibitor-NC+si-NC 組比較，miR-221-3p inhibotor+si-NC 組OD 值降低（P<0.05），遷移及侵襲細胞數減少（P<0.05），凋亡率升高（P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05），P21、Bax蛋白水平升高（P<0.05）；與miR-221-3p inhibotor+si-NC 組比較，miR-221-3p inhibotor+si-FGF14 組OD值升高（P<0.05），遷移及侵襲細胞數增多（P<0.05），凋亡率降低（P<0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2 蛋白水平升高（P<0.05），P21、Bax 蛋白水平降低（P<0.05），見圖5。

圖5 沉默FGF14 能逆轉干擾miR-221-3p 對肺腺癌細胞PC-9增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Fig.5 Silencing FGF14 could reverse effect of interfer?ence miR-221-3p on proliferation，migration，inva?sion and apoptosis of lung adenocarcinoma cell PC-9

3 討論

肺腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，近年來，肺腺癌發病率與病死率逐年上升，已嚴重威脅人類生命安全，目前肺腺癌發病機制尚未闡明，已知miRNA 在肺腺癌形成及發展過程中可發揮重要調控作用，miR-210通過靶向賴氨酰氧化酶樣4促進肺腺癌的增殖、遷移和侵襲［7］。miR-204 靶向SOX4 而抑制肺腺癌的轉移［8］。miR-195通過直接靶向apelin抑制肺腺癌的進展［9］。但miRNA 在肺腺癌發生過程中的作用機制尚未完全闡明，因而本研究積極探尋新型miRNA 分子并探究其在肺腺癌形成過程中的作用機制，為肺腺癌治療提供潛在靶點。

miR-221-3p 和miR-15b-5p 通過靶向Axin2 促進肝癌細胞增殖和侵襲［10］。miR-221-3p 靶向THBS2促進子宮頸癌轉移［11］。miR-221-3p 通過靶向THBS2 促進宮頸鱗狀細胞癌的血管生成［12］。本研究結果顯示，肺腺癌細胞中miR-221-3p 的表達水平升高，提示miR-221-3p 在肺腺癌發生過程中可能發揮重要調控作用。本研究結果顯示，抑制miR-221-3p表達可明顯降低肺腺癌細胞活力。已知細胞活力（增殖）與細胞周期密切相關，CyclinD1 在腫瘤中表達水平升高并可促進細胞周期進展，而P21 表達水平升高可誘導細胞周期阻滯［13］。本研究結果顯示，抑制miR-221-3p 表達可明顯降低CyclinD1 的表達水平，提高P21的表達水平，提示抑制miR-221-3p表達可抑制肺腺癌細胞增殖。MMP-2、MMP-9 在腫瘤細胞中表達水平升高可通過降解細胞外基質沉積從而促進細胞轉移［14］。本研究結果顯示，抑制miR-221-3p 表達可明顯減少肺腺癌細胞遷移及侵襲細胞數，降低MMP-2、MMP-9 的表達水平，提示抑制miR-221-3p 表達可抑制肺腺癌細胞遷移及侵襲。細胞凋亡與增殖失衡可促進腫瘤形成及進展，抗凋亡蛋白Bcl-2 在腫瘤中表達水平升高可抑制細胞凋亡，而Bax 表達水平升高可通過線粒體途徑而促進細胞凋亡［15］。本研究結果顯示，抑制miR-221-3p 表達可提高肺腺癌細胞凋亡率，促進Bax 表達及抑制Bcl-2表達，提示抑制miR-221-3p表達可促進肺腺癌細胞凋亡。

本研究證實miR-221-3p 可靶向結合FGF14，并可負向調控FGF14的表達。FGF14在結直腸癌中表達水平降低，并可調控PI3K/AKT/mTOR 途徑而發揮腫瘤抑制作用［16］。本研究結果顯示，肺腺癌細胞中FGF14 的表達水平降低，進一步研究顯示，沉默FGF14 可明顯提高肺腺癌細胞活力，增加遷移及侵襲細胞數，還可降低細胞凋亡率，提示FGF14 在肺腺癌發生及發展過程中可能發揮抑癌基因作用。同時本研究將抑制miR-221-3p 表達與沉默FGF14聯合作用后細胞活力明顯升高，細胞遷移及侵襲能力明顯增強，而細胞凋亡率明顯降低，提示沉默FGF14 可明顯逆轉抑制miR-221-3p 表達對肺腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用。

綜上所述，肺腺癌細胞中miR-221-3p 的表達水平升高，而FGF14的表達水平降低，抑制miR-221-3p表達可通過上調FGF14 的表達從而抑制肺腺癌細胞增殖、遷移及侵襲，并可促進細胞凋亡，其可能作為肺腺癌治療的潛在靶點。但仍需進行體內動物實驗進一步驗證。