Ⅰ型干擾素應答基因與類風濕關節炎生物制劑療效①

呂明華 王 寧 胡志芳 張 典 郭 娜 （西安醫學院免疫學教研室，西安 710021）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性炎癥性多關節炎為特征的一種自身免疫性疾病。晚期由于軟骨及骨破壞可導致關節畸形和功能障礙，對患者及其家庭均造成極大傷害［1-2］。近年除傳統改善病情的抗風濕藥（disease-modifying anti-rheu‐matic drugs，DMARDs）外，越來越多生物制劑被用于RA 治療，如腫瘤壞死因子抑制劑（tumor necrosis factor inhibitor，TNFi）、IL-6R 抗體、CD20 抗體和CTLA-4 融合蛋白等。生物制劑的使用明顯緩解了部分RA 患者癥狀，使關節損傷得到控制，極大提高了RA 患者生活質量，但生物制劑并不能保證每位RA 患者受益。本文總結TNFi、IL-6受體抗體、CD20抗體和CTLA-4 融合蛋白治療RA 的應答情況及其應答相關基因，以期為RA 患者接受生物制劑治療和改善應答情況提供理論依據。

1 部分RA患者對生物制劑治療不應答

多種生物制劑被用于RA 患者治療（表1）。CD20單克隆抗體-利妥昔單抗（rituximab，RTX）治療RA 的2 個臨床研究結果顯示，分別有42.9%、65.4%、50%或80%的RA 患者不應答。IL-6R 抗體-托珠單抗（Tocilizumab，TCZ）治療RA 研究結果顯示，分別有27.6%、25%、9.9%或21.8%的RA 患者不應答。腫瘤壞死因子抑制劑（tumor necrosis factor inhibitors，TNFi）或TNF-α 單克隆抗體（TNF-α mono‐clonal antibody，TNF mAb）治療RA 的臨床試驗分別有20%、40.6%、47.8%、61.5%、40.9%或41.8%的RA 患者無應答。針對T 細胞表面CTLA4 分子的融合蛋白（CTLA4-Fc）治療RA 結果顯示，22.9%的RA患者不應答。因此，生物制劑治療RA 存在部分患者不應答情況。

表1 部分RA患者對生物制劑無應答Tab.1 Some RA patients did not respond to biological agents

2 Ⅰ型干擾素應答基因表達與生物制劑治療RA應答相關

生物制劑治療價格昂貴，普通家庭難以承受。如果能夠預先評估RA 患者對某種生物制劑的應答情況，制定個體化治療方案，既能保證患者得到及時有效治療，又極大地緩解了RA 患者經濟壓力。因此，尋找能夠預測生物制劑療效的標志分子對RA患者至關重要。

2.1 RA 患者外周血中性粒細胞IRGs 評分與TNFi療效呈正相關 WRIGHT 等［4］分離RA 患者TNFi 治療前外周血中性粒細胞，提取RNA 并測序，發現RA患者中性粒細胞Ⅰ型干擾素應答基因（interferon response genes，IRGs）表達顯著高于健康對照，RA患者接受TNFi治療12周后根據28個關節疾病活動度評分（28 joints disease activity score，DAS28）下降情況（△DAS28）或歐洲風濕病聯盟（European League against Rheumatism，EULAR）標準區分應答者和不應答者。△DAS28 值為RA 患者治療前后DAS28 降低值。△DAS28≥1.2 為應答者，其余為不應答者。根據178個IRGs表達對每個RA患者進行IFN評分，繪制ROC曲線分析IFN評分預測TNFi治療RA應答情況，發現IFN評分越高，應答越好，反之，應答差或不應答。

2.2 RA 患者血清IFNβ 與IFNα 活性比例與TNFi療效呈負相關 WAMPLER 及其團隊收集RA 患者TNFi治療前血清，將其與DMEM 培養基混合配制成含50%RA 患者血清的培養基，加入WISH 細胞中培養6 h 后提取RNA，逆轉錄成cDNA，通過實時定量PCR分析3個IRGs（MX1、PKR和IFIT1）表達，將3個基因表達水平相加即為RA 患者IFN 活性評分值。同時，通過抗體中和血清中IFN-α 或IFN-β 后分析RA 患者血清中IFN 活性，即為IFN-β 活性或IFN-α活性。TNFi 治療12 周后根據EULAR 標準區分RA應答者和不應答者，并分析RA 患者血清Ⅰ型干擾素總活性、IFN-α 活性、IFN-β 活性或IFN-β 與IFN-α活性比例（IFN-β/α）與應答情況的關系，結果顯示RA 患者治療前血清中IFN-β/α 活性比例與RA 患者TNFi治療反應呈負相關［5］。

2.3 RA 患者外周血IFN 評分與TNFi 應答呈負相關 RODRIGUEZ-CARRIO 及其研究團隊收集TNFi治療前早期RA 患者外周血細胞，qPCR 分析血細胞4 個IRGs（IFI44、IFI44L、IFI6和MX1）表達，并計算每個RA 患者IFN 評分。TNFi 治療3 個月后根據EULAR 標準區分應答者和不應答者，并分析IFN 評分與TNFi 治療應答情況關系，發現RA 患者治療基線外周血Ⅰ型干擾素評分較高的RA 患者接受TNFα 阻斷后臨床效果較差。因此，RA 患者治療基線外周血細胞IFN評分與TNFi應答呈負相關［6］。

2.4 RA 患者外周血IFN 評分與RTX 應答呈負相關 對TNFi 治療失敗的RA 患者可采用RTX 進一步治療。有學者對接受RTX 治療6 個月的RA 患者治療基線外周血細胞進行基因表達譜分析，鑒別RA 應答者和不應答者差異表達基因。將測序結果和應答情況結合分析，發現8個IRGs（LY6E、HERC5、IFI44L、ISG15、MxA、MxB、EPSTI1和RSAD2）表達與RTX 應答相關。以IRGs 基因表達平均值作為IFN評分繪制ROC 曲線，3 基因聯合（EPSTI1、RSAD2和MxA）或8 基因聯合（LY6E、HERC5、IFI44L、ISG15、MxA、MxB、EPSTI1和RSAD2）繪制的ROC 曲線均可獲得較高AUC 值。以△DAS28 值區分RA 應答者和無應答者時，3 基因聯合AUC 值為0.87，8 基因聯合AUC 值為0.82。以EULAR 標準區分RA 應答者和無應答者時，3 基因聯合AUC 值為0.83，8 基因聯合AUC 值為0.78［1］。IFN 評分低預示其對RTX 治療應答，可采用RTX治療，反之不應答，不予RTX治療。

2.5 RA 患者外周血PBMC 高表達IRGs 與TCZ 應答相關 已知TCZ 能夠顯著降低急性炎癥反應標志分子血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）和C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平，且這種降低與患者對TCZ 應答與否無關。因此，包含ESR 和CRP 的DAS28 評分和EULAR 應答標準均不適合評估TCZ 治療RA 的應答情況。研究者通過風濕病醫生的全面評價以及臨床疾病活動度指數（clinical disease activity index，CDAI）判斷RA 患者對TCZ 是否應答，結果顯示，治療基線RA 患者外周血單個核細胞較健康人顯著上調表達的4 個基因（IFI6、MT1G、MX2和OASL）與治療反應相關，其中3 個基因（IFI6、MX2和OASL）為Ⅰ型干擾素相關基因，且治療基線外周血單個核細胞高表達IFI6、MT1G、MX2和OASL的活動性RA 患者極有可能對TCZ 治療應答［3］。

2.6 RA 患者外周血細胞高表達IRGs 與阿巴西普應答相關 新近研究收集RA 患者接受阿巴西普治療前和治療6 個月后外周血細胞進行測序分析，并根據EULAR 標準區分應答者和無應答者。通過3 個IRGs（OAS3、MX1和IFIT3）表達計算IFN 評分。根據RA 患者治療前外周血IFN 評分值繪制ROC 曲線，AUC 值為0.92。同時發現RA 應答者治療前外周血細胞高水平表達9個與樹突狀細胞或Ⅰ型干擾素相關基因，分別為BATF2、LAMP3、CD83、CLEC4A、IDO1、IRF7、STAT1、STAT2和TNFSF10。因此，IFN評分和9 個基因表達水平可作為RA 患者對阿巴西普臨床應答相關的新型生物標志物。IFN 評分高預示其對阿巴西普治療極有可能應答，評分低預示不應答［7］。

以上研究選用生物制劑治療前RA 患者外周血血清或不同細胞群（外周血細胞、中性粒細胞、外周血單個核細胞）作為研究對象，尋找能夠預測生物制劑療效的標志分子。提示RA患者體內IRGs表達與TNFi、RTX、TCZ和阿巴西普治療RA應答相關。

3 pDCs產生Ⅰ型干擾素水平決定IRGs表達

IFN-I 與其細胞表面受體結合后啟動下游IRGs表達。漿細胞樣樹突狀細胞（plasma cell like dendritic cells，pDCs）是Ⅰ型干擾素產生的主要細胞，因此，RA 患者IRGs 表達與其體內pDCs 數和pDCs 產生Ⅰ型干擾素的水平密切相關。

3.1 RA 患者體內pDCs 分布及Ⅰ型干擾素表達異常 研究報道，RA患者病程早期，骨髓中pDCs前體細胞（CD34+BDCA2+）分化發育增多［10］。且早期未接受藥物治療的RA 患者外周血中pDCs 比例較健康人群顯著下降［11］。相較于骨關節炎（osteoarthritis，OA）患者，RA 患者滑膜組織和膝關節滑液中均有pDCs 聚集［12］。提示RA 患者體內pDCs 分布發生變化，外周血pDCs數減少，而膝關節炎癥局部pDCs聚集，表明pDCs可能在RA中發揮重要作用。

人類Ⅰ型干擾素包括12 種亞型IFN-α、IFN-β、IFNω、IFNκ 和IFNε，其中以IFN-α 和IFN-β 作用研究較多。RA患者外周血Ⅰ型干擾素水平尚未見報道。免疫組織化學染色發現RA 患者滑膜組織中存在IFN-α和IFN-β表達［12-13］。系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者外周血pDC 比例下降，在其皮膚組織和腎臟中有pDCs細胞浸潤。同時SLE患者血清中Ⅰ型干擾素水平較健康人群顯著升高，且外周血pDCs 產生IFNs 能力增強［14］。而RA 患者外周血和炎癥局部pDCs 產生Ⅰ型干擾素能力未知。因此，關于RA 患者血清中Ⅰ型干擾素水平、外周血pDCs和滑膜組織pDCs產生Ⅰ型干擾素的能力仍需進一步研究，從而完善pDCs及Ⅰ型干擾素參與RA的機制。

3.2 調控pDCs 產生Ⅰ型干擾素的因素 pDCs 是產生IFN-I 的主要細胞，其產生IFN-I 的水平受多種因素調控。SALVI 等［15］發現，外泌體來源microRNA作為內源性Toll 樣受體7（toll like receptor 7，TLR7）配體可促進人pDCs 產生IFN-α［15］。且人pDCs 表達12 種IFN-α 亞型的水平存在性別差異［16］。pDCs 表面BDCA2 分子和白細胞相關免疫球蛋白樣受體1（leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1，LAIR1）可抑制人pDCs 產生Ⅰ型干擾素［17-18］。狼瘡患者體內，IgE 可抑制pDCs 內TLR7 和TLR9 介導的IFN-α 產生［19］。其次，胞漿內核酸與二聚化的干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）結合后，STING 與cGAMP 結合，使IRF3 磷酸化，磷酸化的IRF3 入核誘導IFN-I 表達。同時，STING 也可通過介導IFI16 泛素化降解負反饋調控pDCs 產生Ⅰ型干擾素［20］。亦有學者發現，STING-β可拮抗STING-α 作用，抑制Ⅰ型干擾素產生［21］。而大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CB2）特異性激動劑能夠抑制pDCs 內關鍵轉錄因子IRF7 磷酸化，從而抑制IFN-α 產生［22］。綜上所述，人pDCs 產生Ⅰ型干擾素的水平受microRNA、性別、細胞表面抑制性分子（BDCA2 和LAIR1）、免疫球蛋白和胞漿內核酸識別受體等多個因素調控。

3 干預pDCs 功能對RA 患者生物制劑治療不敏感有意義

RA 患者使用生物制劑治療存在較大不應答率，如何提高或改善RA 患者對生物制劑的不敏感性是臨床急需解決的問題。通過以上研究分析發現目前常用生物制劑（TNFi、RTX、TCZ 和阿巴西普）應答情況與RA 患者體內IRGs 表達相關。而IRGs是體內Ⅰ型干擾素與其細胞表面受體結合后刺激細胞表達的基因。因此，IFN-I及其受體表達水平決定RA 患者IRGs 表達情況。pDCs 作為Ⅰ型干擾素產生的主要細胞，可通過干預RA 患者體內pDCs 功能從而改變IRGs 表達，并最終改善RA 患者對生物制劑治療不敏感的情況。比如采用BDCA2 或LAIR1 分子阻斷抗體或激活抗體調控pDCs 產生Ⅰ型干擾素的水平，從而提高或降低RA 患者體內IRGs 表達；或采用IFN-α 或IFN-β 中和抗體阻斷其與受體結合，從而降低IRGs表達，最終改善RA患者對生物制劑治療不敏感的情況，但具體機制還需進一步研究。

4 總結與展望

RA 是一種多因素相互作用引發的自身免疫性疾病。生物制劑治療受到越來越多RA 患者青睞。但RA 患者對各種生物制劑的應答情況不容樂觀。本文綜述了多個生物制劑用于RA 治療的應答情況，發現存在不同程度不應答概率（20%～80%），但不同生物制劑應答情況均與RA患者體內IRGs表達相關。TNFi 治療應答與患者治療基線外周血細胞IFN 評分和血清中IFNβ/IFNα 活性比例呈負相關，與患者治療基線外周血中性粒細胞IFN 評分呈正相關。RTX 治療應答與患者治療基線外周血細胞IRGs 表達呈負相關。TCZ 治療應答與患者治療基線PBMC 高表達IRGs 相關。阿巴西普治療應答與患者治療基線外周血細胞高水平表達IRGs 相關。雖然4 種生物制劑治療RA 應答情況均與IRGs 表達相關，但不同生物制劑靶細胞群存在差異。對于同一種生物制劑治療RA 的療效，如TNFi，3 項研究分析細胞組分不同，得到相反結論。同時，Ⅰ型干擾素應答基因較多，每項研究分析的基因及其數目也不相同。這些情況增加了臨床醫生對RA 患者生物制劑治療前療效預測的難度。其次，各項研究樣本數量有限，可能影響IRGs 預測生物制劑療效的價值。因此，后期臨床研究需在擴大樣本量基礎上選用相同細胞群或細胞組分和相同IRGs 基因群進行分析，從而制定一個統一的標準同時預測不同生物制劑治療RA 的應答情況。對于計劃接受生物制劑治療的RA 患者，可通過分析IRGs 表達情況預測其對不同生物制劑的應答情況，從而指導臨床醫生選擇合適的生物制劑達到良好治療效果。同時，pDCs作為Ⅰ型干擾素產生的主要細胞，IRGs 表達受RA患者體內IFN-I水平影響，而pDCs是Ⅰ型干擾素產生的主要細胞。因此，通過調控pDCs細胞產生Ⅰ型干擾素的水平，從而調控RA患者體內IRGs表達，對改善RA患者對生物制劑應答具有重要意義。