基于阿爾茨海默癥模型大鼠的開心散藥動學研究

馮曉曉，王彬斌，陳 東，仇 峰，龔慕辛，李朝霞

基于阿爾茨海默癥模型大鼠的開心散藥動學研究

馮曉曉，王彬斌，陳 東，仇 峰，龔慕辛，李朝霞*

首都醫科大學中醫藥學院 中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069

表征開心散各成分在寡聚態β淀粉樣蛋白1-42（β amyloid protein 1-42，Aβ1-42）誘導阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）模型大鼠體內的藥動學行為，建立并驗證同時測定大鼠血漿中開心散各成分含量的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法。采用雙側海馬注射寡聚態Aβ1-42的方法建立AD大鼠模型，開心散單次ig給藥，于不同時間點取血，測定各成分的血藥濃度。采用DAS 2.0軟件以非房室模型擬合，計算藥動學參數。建立的UPLC-MS/MS方法的精密度、準確度、提取回收率、基質效應和穩定性等方法學考察結果均符合生物樣品分析的測定要求。Morris水迷宮實驗證實成功構建AD大鼠模型（＜0.05）。AD模型大鼠給予開心散后，按中藥化學結構分類的同型化合物具有相似的藥動學特征，如屬于同分異構體的α-細辛醚和β-細辛醚、同屬于羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜的去氫土莫酸與松苓新酸以及同屬于3,4-開環-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜的茯苓新酸A和茯苓新酸B等。α-細辛醚和β-細辛醚的達峰時間（max）和消除半衰期（1/2）均較短，表明二者在AD模型大鼠體內吸收迅速，消除也快；茯苓新酸A和茯苓新酸B的達峰時間（max）較短，但二者的半衰期（1/2）卻較長，表明它們吸收迅速，但消除緩慢。去氫土莫酸和松苓新酸達峰時間（max）和半衰期（1/2）均較長，吸收和消除緩慢。此外，去氫土莫酸的藥時曲線存在雙峰現象，其平均滯留時間（MRT）也較長，這可能源于較強的肝腸循環，延長了其作用時間。揭示了AD疾病狀態下開心散的體內藥動學過程，為闡明開心散成分體內過程及其后續研究開發提供參考。

開心散；阿爾茨海默癥；藥動學；超高效液相色譜-串聯質譜；寡聚態β淀粉樣蛋白1-42；α-細辛醚；β-細辛醚；茯苓新酸A；茯苓新酸B；去氫土莫酸；松苓新酸

開心散源自唐代孫思邈所著的《備急千金要方》[1]，由人參、遠志、石菖蒲、茯苓4味藥組成，“主好忘”，歷代醫家記載開心散對健忘、怔忡等病癥具有良好的治療作用[2-4]。較多現代研究證實開心散在治療阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）方面具有良好的應用前景[5-9]，然而其體內過程、起效機制與臨床合理應用尚不明確，有待深入研究。

藥動學研究可揭示中藥復方中有效成分的動態變化規律，為闡明復方的藥效物質基礎與作用機制提供依據[10]。目前開心散及其類方的藥動學研究主要聚焦于源自人參和遠志中的部分化學成分，如人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、遠志𠮿酮III、西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6等[11-18]，但對方中源自石菖蒲與茯苓的成分涉及較少。究其原因，可能是因為石菖蒲與茯苓成分在藥材中含量較低，且生物利用度不高，檢測難度大。本課題組在前期研究中選用臨床應用較多的經典開心散組方[19-23]，證實其能夠有效改善AD模型動物/轉基因小鼠的學習記憶能力。鑒于此方重用石菖蒲和茯苓（人參、遠志、石菖蒲、茯苓為1∶1∶25∶50），因此有必要在開展藥動學研究時重視源自石菖蒲和茯苓2味藥中的成分，以期全面表征開心散的藥動學特征。

此外，AD疾病狀態可能會導致開心散的體內過程發生改變，影響臨床精準用藥，故以AD模型動物為研究對象開展藥動學研究可更好地闡明開心散各成分的體內過程[24]。因此，本研究選用雙側海馬CA1區立體定位注射寡聚態β淀粉樣蛋白1-42（β amyloid protein 1-42，Aβ1-42）建立AD模型大鼠，建立并驗證超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法測定開心散中待測成分的血藥濃度，對開心散的體內過程進行研究，以期為開心散的臨床研究和應用提供參考。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠，體質量（250±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SYXK（京）2016-0006。動物飼養于溫度（25±2）℃、濕度（50±10）%的屏障環境內，給予標準顆粒飼養并自由飲水，每日光照12 h。實驗前，適應性飼養7 d。倫理審查由首都醫科大學倫理委員會批準，倫理編號AEEI-2018-101，所有動物實驗均在中華人民共和國科技部頒布的實驗動物護理和使用的指導下進行。

1.2 藥材

開心散由人參、遠志、石菖蒲和茯苓組成。人參（批號16110803）、石菖蒲（批號17110103）和茯苓（批號17111504）購自北京能濟中藥飲片有限公司，遠志（批號16080803）購自北京明輝恒通藥業有限公司，經首都醫科大學中醫藥學院李佳副教授鑒定分別為五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖、天南星科植物石菖蒲Schott.的干燥根莖、多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核和遠志科植物遠志Willd.的干燥根，均符合《中國藥典》規定。

1.3 試劑

開心散待測成分的化學結構見圖1。對照品α-細辛醚（批號PS001187，質量分數＞98%）、去氫土莫酸（批號PS011211，質量分數＞98%）、茯苓新酸A（批號PS010102，質量分數＞97%）、鹽酸丁螺環酮（批號6-EOD-111-1，質量分數＞98%）和斯皮諾素（批號PS000864，質量分數＞98%）購自成都普思生物科技股份有限公司；β-細辛醚對照品（批號11208-201601，質量分數為96.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品松苓新酸（批號Y08J7H8750，質量分數＞98%）、茯苓新酸B（批號P13J9L63651，質量分數＞95%）購自上海源葉生物科技有限公司；色譜純甲醇、色譜純甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；Aβ1-42購自MCE公司。

1.4 儀器

QTRAP6500型UPLC-QQQ-MS/MS（美國AB Sciex公司）；DV215CD型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；V0400型真空干燥箱（德國Memmert公司）；3K15型低溫高速離心機（美國Sigma公司）；MG-2200型氮吹儀（日本EYELA公司）；ZH-2型渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；68025型腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；788130型顯微注射泵（美國KDS公司）；78001型顱鉆（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；63031型水迷宮實驗設備（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

圖1 開心散中待測成分的化學結構

2 方法

2.1 開心散的制備

將4味藥材粉碎，過24目篩得到中藥粗粉。按比例稱取藥材粉末，加入12倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取2 h，濾過，濾渣用10倍量70%乙醇，回流提取1 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，干燥，得開心散提取物。經檢測，每克開心散復方中含β-細辛醚1194 μg、α-細辛醚125.0 μg、去氫土莫酸193.2 μg、茯苓新酸A 9.326 μg、茯苓新酸B 10.93 μg、松苓新酸12.23 μg[23]。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取α-細辛醚、β-細辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B對照品適量，以甲醇溶解，分別配制成質量濃度為1.00 mg/mL的單一對照品溶液。精密吸取上述單一對照品溶液，以甲醇稀釋，配制為系列混合對照品溶液，于?20 ℃保存。

精密稱取丁螺環酮和斯皮諾素對照品適量，以甲醇溶解，分別配制成質量濃度為1.00 mg/mL的單一對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液，用甲醇-乙腈溶液（1∶1）稀釋，得到內標溶液（含丁螺環酮10 ng/mL、斯皮諾素500 ng/mL），于?20 ℃保存。

2.3 色譜條件和質譜條件

2.3.1 色譜條件 安捷倫1290 Inifinity型超高效液相色譜儀，配有G4220A泵、G1316C柱溫箱、G4226A進樣器、G1330B恒溫器。色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的甲醇溶液（B），梯度洗脫：0～1.0 min，35% B；1.0～3.0 min，35%～70% B；3.0～5.5 min，70%～73% B；5.5～5.6 min，73%～90% B；5.6～7.0 min，90% B；7.0～7.1 min，90%～100% B；7.1～9.0 min，100% B；9.0～9.1 min，100%～35% B；9.1～10.0 min，35% B。柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣體積2.0 μL。

2.3.2 質譜條件 AB SCIEX API 4000?三重四級桿質譜儀，離子源為電噴霧離子源（ESI），采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，在正負離子模式下同時檢測，質譜參數如下：不同離子模式下氣簾氣137.90 kPa；毛細管溫度500 ℃；入口電壓±10 V；離子噴霧電壓±4500 V；霧化器氣體344.75 kPa，加熱器氣體344.75 kPa；碰撞池出口電壓正離子模式82.74 kPa，負離子模式?13.0 V。開心散待測成分與內標的質譜參數見表1。

2.4 血漿樣品的處理

取血漿樣品，在室溫下解凍，渦旋30 s，精密吸取血漿樣品50 μL，加入10 μL甲醇溶液、150 μL含2種內標的甲醇-乙腈溶液（1∶1），渦旋30 s。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液定量轉移至離心管，氮氣流下蒸干。殘渣加50 μL甲醇復溶，渦旋混勻30 s，超聲處理5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液進樣分析。

表1 開心散待測成分及內標的質譜參數

Table 1 Mass spectrum conditions of analytes of Kaixin Powder and internal standard

化合物ESI模式母離子(m/z)子離子(m/z)去簇電壓/V碰撞能量/eV α-細辛醚＋209.2194.18021.0 β-細辛醚＋209.1194.18021.0 鹽酸丁螺環酮＋386.0122.014537.2 去氫土莫酸?483.5483.5?220?45.8 松苓新酸?453.3453.3?220?46.7 茯苓新酸A?497.5423.2?190?40.8 茯苓新酸B?483.4465.1?200?33.5 斯皮諾素?607.3427.3?200?41.3

2.5 方法學驗證

根據《中國藥典》2020年版四部中的生物樣品定量分析方法驗證指導原則對本研究建立的定量分析方法進行系統驗證。

2.5.1 選擇性 比較空白血漿、空白血漿中加入定量下限（low limits of quantification，LLOQ）對照品和內標溶液以及大鼠開心散30 min后的血漿樣品的MRM質譜圖，考察方法的選擇性。

2.5.2 線性及LLOQ 分別取大鼠空白血漿50 μL，加入10 μL系列質量濃度的混合對照品溶液，按樣品測定方法處理測定。混合對照品溶液配制如下：分別定量吸取α-細辛醚、β-細辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B母液，加入定量甲醇，配制成混合對照品溶液，吸取一定量的混合對照品溶液，用甲醇稀釋成系列混合對照品溶液。α-細辛醚、去氫土莫酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B的標準曲線質量濃度均為500、200、100、50.0、25.0、10.0、5.00、2.00 ng/mL；β-細辛醚的標準曲線質量濃度為1000、500、200、100、50.0、25.0、10.0、5.00、2.00、1.00 ng/mL；松苓新酸的標準曲線質量濃度為1000、500、200、100、50.0、25.0、10.0 ng/mL。以對照品質量濃度為橫坐標（），以對照品峰面積與內標峰面積比值為縱坐標（），用加權最小二乘法進行線性回歸，建立待測成分對照品在大鼠空白血漿中的標準曲線，確定待測成分LLOQ。

2.5.3 精密度與準確度 取一個分析批的LLOQ及低、中、高3種質量濃度質控樣品（每個濃度6份樣品），并制備標準曲線同批測定，計算各成分的日內精密度和準確度；連續測定3個分析批（3 d內），計算各成分的日間精密度和準確度。

2.5.4 穩定性 制備低、中、高質量濃度的質控樣品，進行室溫放置24 h，?80 ℃保存7 d，?80 ℃反復凍融3次實驗，測定（各實驗每個濃度6份樣品）。

2.5.5 提取回收率 制備低、中、高質量濃度的質控樣品，每個濃度6份樣品，進樣分析。取空白血漿，除不加混合對照品溶液之外按樣品處理，氮吹后加入混合對照品溶液，進樣分析。將質控樣品峰面積和氮吹后加入標準溶液的樣品的峰面積相比，計算各成分的提取回收率。

2.5.6 基質效應 取空白血漿，除不加混合對照品溶液之外按樣品處理，氮吹后再加入混合對照品溶液，制備含有基質的低、中、高質量濃度樣品，每個質量濃度6份樣品。制備不含基質的樣品（待測成分和內標的純溶液），每個質量濃度6份樣品。進樣分析考察基質效應。

2.6 AD模型大鼠的建立

2.6.1 寡聚態Aβ1-42的制備 取Aβ1-42粉末1 mg，加入二甲基亞砜和無菌生理鹽水，配制成質量濃度為1 μg/μL的Aβ1-42溶液（含5%二甲基亞砜）。37 ℃孵育3 d，于?80 ℃保存備用。

2.6.2 造模 雄性SD大鼠采用雙側海馬CA1區立體定位注射寡聚態Aβ1-42造模[25-28]。大鼠麻醉去毛備皮后固定在腦立體定位儀上，消毒，切開顱骨外皮膚，去除骨膜。以前囟為原點，在前囟后?3.3 mm、左右±2.2 mm、背腹側?2.8 mm處，使用微量注射器各注射5 μL Aβ1-42（1 μg/μL），注射速度為1 μL/min，注射結束后留針5 min。退針后縫合傷口，傷口處用碘伏消毒，并給予青霉素粉末抗菌。

2.6.3 Morris水迷宮實驗 手術1周后，采用Morris水迷宮測試評價動物學習記憶能力。第1天起將平臺置于某一象限，進行定位航行實驗，記錄逃逸潛伏期，共實驗5 d，定位航行實驗結束24 h后，進行空間探索實驗，記錄動物在120 s內的穿越平臺次數、目標象限時間比以及目標象限距離比。造模成功大鼠用于藥動學實驗。

2.7 藥動學研究

取上述經驗證造模成功的AD模型大鼠6只，實驗前禁食12 h，可自由飲水。大鼠ig開心散（10 g/kg），分別于給藥前和給藥后5、10、15、30 min及1、2、4、6、8、12、24 h時間點，取靜脈血200 μL至含有肝素鈉的離心管中，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血漿，于?80 ℃保存。

2.8 數據處理

在Morris水迷宮實驗中，定位航行實驗結果使用雙因素重復測量方差分析。空間探索實驗中穿越平臺次數采用非參數檢驗分析，其他數據采用單因素方差分析。數據以表示。

使用DAS 2.0軟件以非房室模型計算成分的藥動學參數。使用GraphPad Prism v6.0軟件繪制血藥濃度-時間曲線。數據以表示。

3 結果

3.1 Morris水迷宮評價AD模型大鼠

如圖2所示，在定位航行實驗的第1、2、3天，AD模型大鼠的逃逸潛伏期較正常大鼠更長（＜0.05），說明AD模型大鼠找到水下隱藏平臺需要更長的時間；在空間探索實驗中，AD模型大鼠穿越平臺的次數、目標象限時間比和目標象限距離比均明顯低于正常大鼠（＜0.05）。綜上，行為學實驗結果表明AD模型大鼠模型建立成功。

3.2 方法學考察

3.2.1 選擇性 如圖3所示，各化合物峰形良好，大鼠血漿中的內源性物質、可能的代謝產物等對待測成分和內標的測定無干擾。

與正常組比較：*P＜0.05

1-β-細辛醚 2-α-細辛醚 3-去氫土莫酸 4-茯苓新酸B 5-茯苓新酸A 6-松苓新酸 7-丁螺環酮 8-斯皮諾素

3.2.2 線性和LLOQ 采用UPLC-MS/MS法測定AD模型大鼠血漿中開心散待測成分的LLOQ及標準曲線的線性回歸方程，如表2所示，各成分在相應質量濃度范圍內顯示出良好的線性。

3.2.3 精密度和準確度 如表3所示，各成分的日內精密度和日間精密度均在±15%以內，日內準確度和日間準確度均在±15%以內，符合要求。

3.2.4 穩定性 穩定性考察結果見表4。室溫放置24 h，?80 ℃保存7 d，?80 ℃反復凍融3次實驗樣品測定結果符合要求。

3.2.5 提取回收率和基質效應 提取回收率和基質效應結果見表5，各成分提取回收率為86.36%～97.47%，RSD值為1.45%～6.60%，基質效應為80.50%～100.23%，RSD值為0.95%～6.88%，均符合要求。

3.3 藥動學實驗結果

采用建立的UPLC-MS/MS方法，檢測AD模型大鼠給藥開心散后待測成分在不同時間點的血藥濃度，繪制得到平均血藥濃度-時間曲線，見圖4。采用DAS 2.0軟件，以非房室模型計算AD模型大鼠給藥開心散后待測成分的藥動學參數，結果見表6。結果顯示，α-細辛醚的達峰時間（max）值與半衰期（1/2）值分別為（0.26±0.12）、（0.54±0.25）h，β-細辛醚的max值與1/2值分別為（0.21±0.05）、（0.65±0.24）h，兩者的達峰時間與半衰期均較短。去氫土莫酸的max值與1/2值分別為（3.92±4.11）、（3.57±1.04）h，松苓新酸的max值與1/2值分別為（1.25±0.61）、（5.43±2.25）h，兩者的達峰時間與半衰期均較長。茯苓新酸A和茯苓新酸B的max值分別為（0.28±0.11）、（0.24±0.03）h，兩者的1/2值分別為（3.90±1.67）、（7.99±2.88）h，成分達峰時間較短但半衰期較長。

表2 開心散待測成分的線性回歸方程及LLOQ

Table 2 Calibration curves and LLOQ of analytes of Kaixin Powder

化合物線性方程r線性范圍/(ng·mL?1)LLOQ/(ng·mL?1) α-細辛醚y＝8.383×10?4 x＋5.130×10?40.998 32.0～500.02.0 β-細辛醚y＝5.768×10?4 x－2.469×10?20.995 91.0～1 000.01.0 去氫土莫酸y＝1.925×10?4 x＋2.563×10?40.995 72.0～500.02.0 松苓新酸y＝1.250×10?5 x＋4.300×10?40.999 610.0～500.010.0 茯苓新酸Ay＝9.476×10?5 x－1.191×10?40.997 12.0～500.02.0 茯苓新酸By＝1.250×10?5 x＋1.410×10?40.996 82.0～500.02.0

表3 開心散待測成分的精密度和準確度(, n = 6)

Table 3 Accuracy and precision of analytes of Kaixin Powder (, n = 6)

化合物質量濃度/(ng·mL?1)日內日間 實測值/(ng·mL?1)準確度/%精密度/%實測值/(ng·mL?1)準確度/%精密度/% α-細辛醚2.02.11±0.08105.583.852.06±0.02103.091.17 5.05.06±0.12101.302.445.13±0.04102.580.72 50.052.10±2.60104.204.9952.25±1.96104.503.75 400.0400.92±12.03100.233.00411.56±18.68102.894.54 β-細辛醚1.01.00±0.07100.177.271.01±0.02101.392.23 2.01.94±0.1496.927.121.99±0.0699.923.18 50.051.13±1.14102.262.2250.96±0.64101.911.25 800.0775.60±26.1496.953.37771.92±28.0296.493.63 去氫土莫酸2.02.07±0.10103.334.952.04±0.03101.751.60 5.05.03±0.08100.631.505.03±0.03100.580.55 50.051.32±1.62102.633.1653.71±2.73107.425.08 400.0389.56±6.5897.391.69389.68±12.4797.423.20 松苓新酸10.010.46±0.61104.625.8410.44±0.42104.394.02 20.020.47±0.73102.343.5720.44±0.08102.210.39 100.0103.95±1.37103.951.32104.21±1.32104.211.27 400.0407.16±7.25101.791.78398.52±7.6999.631.93 茯苓新酸A2.02.06±0.08103.254.072.09±0.04104.531.72 5.05.26±0.27105.105.135.16±0.19103.273.68 50.051.42±1.90102.843.7054.22±2.67108.444.93 400.0414.00±11.84103.502.86395.92±21.5898.985.45 茯苓新酸B2.02.04±0.12101.836.042.22±0.21111.199.27 5.05.06±0.16101.203.225.14±0.10102.721.98 50.051.67±1.66103.343.2253.60±1.70107.203.18 400.0396.72±10.9099.182.77385.00±16.7996.254.36

表4 開心散待測成分的穩定性(, n = 6)

Table 4 Stability of analytes of Kaixin Powder (, n = 6)

化合物質量濃度/(ng·mL?1)室溫放置24 h?80 ℃凍存7 d反復凍融3次 實測值/(ng·mL?1)準確度/%精密度/%實測值/(ng·mL?1)準確度/%精密度/%實測值/(ng·mL?1)準確度/%精密度/% α-細辛醚5.05.16±0.01103.200.195.04±0.05100.870.985.10±0.16101.933.05 50.051.92±0.89103.831.7150.44±2.07100.874.1049.48±2.2798.964.58 400.0396.56±10.1999.142.57395.56±16.2298.894.10370.96±2.5692.740.69 β-細辛醚2.01.97±0.2198.3310.472.02±0.08101.174.142.02±0.10100.834.89 50.051.22±1.15102.432.2451.15±1.87102.313.6651.80±1.32103.612.55 800.0787.84±11.2798.481.43749.68±18.1493.712.42860.80±29.18107.603.39 去氫土莫酸5.05.06±0.04101.270.755.04±0.05100.871.025.01±0.13100.132.53 50.052.94±0.98105.871.8552.00±1.59104.013.0551.46±1.38102.932.68 400.0405.76±4.75101.441.17382.00±9.3695.502.45402.04±12.10100.513.01 松苓新酸20.020.81±0.35104.051.6920.18±0.14100.900.6719.76±0.1298.780.59 100.0105.66±2.74105.662.59105.30±3.34105.303.1799.79±2.9499.792.95 400.0393.88±3.2798.470.83395.88±7.3298.971.85394.48±7.3498.621.86 茯苓新酸A5.05.12±0.13102.472.525.44±0.15108.802.715.31±0.34106.136.44 50.050.10±2.24100.204.9452.74±1.92105.493.6451.14±3.97102.287.77 400.0401.48±13.53100.373.37383.00±13.7195.753.58402.04±12.10100.513.01 茯苓新酸B5.05.03±0.15100.602.945.15±0.05103.000.895.31±0.05106.201.00 50.053.02±1.74106.033.2949.22±0.3698.450.7351.36±3.10102.736.03 400.0389.68±10.1797.422.61381.32±8.7795.332.30 388.23±6.1397.071.58

表5 開心散待測成分的提取回收率和基質效應(, n = 6)

Table 5 Recovery and matrix effect of analytes of Kaixin Powder (, n = 6)

化合物質量濃度/(ng·mL?1)提取回收率/%基質效應/% α-細辛醚5.095.07±3.0893.39±6.35 50.088.12±2.5984.37±2.88 400.086.72±3.1080.50±1.27 β-細辛醚2.090.81±2.1498.01±6.88 50.090.86±1.5887.54±1.91 800.089.46±2.3584.87±2.11 去氫土莫酸5.097.47±6.60100.28±1.24 50.094.31±3.3996.95±2.57 400.096.83±1.6499.69±2.51 松苓新酸20.087.50±2.5690.41±2.48 100.090.85±1.4580.88±1.27 400.097.08±2.5692.69±0.95 茯苓新酸A5.086.50±3.1491.54±4.17 50.090.71±4.0791.19±4.47 400.095.95±5.6296.65±2.20 茯苓新酸B5.086.36±2.1192.16±6.08 50.092.85±4.6493.93±5.58 400.096.29±4.7498.00±3.99

4 討論

4.1 目標成分選擇

基于復方配伍藥味相關文獻參考分析[29-30]，本研究在初期選擇開心散中人參皂苷類成分（人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re）、遠志𠮿酮類成分（遠志𠮿酮III）、寡糖酯類成分（3,6′-二芥子酰基蔗糖）、細辛醚類成分（α-細辛醚和β-細辛醚）、茯苓三萜酸類成分（去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B）作為藥動學檢測的目標成分，但由于開心散中人參和遠志的配伍比例比較低，導致人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、3,6′-二芥子酰基蔗糖和遠志𠮿酮III等在復方中的含量較低，因此在血漿樣品中其含量低于LLOQ，未能被準確定量。本研究最終以α-細辛醚、β-細辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B為檢測成分進行開心散的藥動學表征。

圖4 AD模型大鼠ig開心散后待測成分的平均血藥濃度-時間曲線(, n = 6)

表6 AD模型大鼠ig開心散后待測成分的藥動學參數(, n = 6)

Table 6 Pharmacokinetic parameters of analytes in AD rats after ig Kaixin Powder (, n = 6)

參數單位α-細辛醚β-細辛醚去氫土莫酸松苓新酸茯苓新酸A茯苓新酸B tmaxh0.26±0.120.21±0.053.92±4.411.25±0.610.28±0.110.24±0.03 Cmaxng·mL?135.88±5.81269.00±45.30120.38±53.68114.88±37.1991.56±36.28117.30±54.65 AUC0～tng·mL?1·h38.52±13.01329.20±106.131 373.54±530.78640.55±187.42193.15±59.51398.54±137.70 AUC0～∞ng·mL?1·h39.92±13.19354.17±111.261 381.30±530.43795.20±208.57213.27±49.45498.05±210.28 t1/2h0.54±0.250.65±0.243.57±1.045.43±2.253.90±1.677.99±2.88 MRT0～th0.91±0.580.77±0.308.53±1.014.49±0.783.19±0.865.18±0.49 MRT0～∞h0.99±0.570.97±0.378.67±1.047.88±2.494.14±1.0110.92±6.04 CLz/FL·h?1·kg?132.63±18.7038.87±20.721.55±0.490.16±0.050.46±0.130.25±0.11 Vz/FL·kg?121.73±7.0535.00±15.918.43±4.651.35±0.913.26±2.212.21±1.63

4.2 檢測條件優化與樣品處理優化

通過比較正負離子模式下各成分的響應，本研究選擇了響應更高的離子模式進行檢測：α-細辛醚和β-細辛醚在正離子模式下檢測；去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B在負離子模式下進行檢測。不同檢測離子模式下需要選用不同的內標成分，本研究選擇鹽酸丁螺環酮作為正離子模式下的內標成分，選擇斯皮諾素作為負離子模式下的內標成分。

通過對比使用水-甲醇、水-乙腈作為流動相時各成分的響應，發現各成分在甲醇作為有機相時響應更高；在流動相中加入0.1%甲酸水溶液后成分峰形有所優化，最終選定以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液為流動相。

處理血漿樣品處理時，為保證蛋白沉淀完全，本研究選擇50 μL血漿中加入150 μL甲醇-乙腈混合溶液（1∶1）進行樣品處理。此外，由于血漿樣品中成分含量較低，本研究取沉淀蛋白所得上清液定量，氮吹濃縮，殘渣用50 μL甲醇復溶，離心取上清液進樣測定。

4.3 AD大鼠模型的建立與評價

AD是一種以β淀粉樣蛋白沉積形成的“老年斑”與Tau蛋白磷酸化形成的神經纖維纏結為主要特征的神經退行性疾病，其發病機制較為復雜，目前相關假說多樣包括有Aβ沉積學說、膽堿能學說、Tau蛋白假說、氧化應激學說、神經血管學說等[31-33]，其中Aβ沉積學說占據主要地位。本課題組前期研究表明，開心散可在一定程度上改善AD模型動物（/轉基因小鼠）的Aβ沉積，因此，本研究選擇基于Aβ沉積相關的AD大鼠模型進行藥動學研究。目前研究表明，采用Aβ1-42腦內定位注射方法建立的AD大鼠模型穩定，可重復且操作簡便[23,33]。因此，本研究選用該方法進行AD大鼠模型建立，并采用AD動物模型的經典評價指標Morris水迷宮實驗[31-32]進行AD大鼠模型的評價。

4.4 開心散各成分的藥動學特征分析

α-細辛醚和β-細辛醚互為同分異構體，化學結構相似，因而兩者體內過程相似，多個藥動學參數值相近，藥動學參數表明ig開心散后α-細辛醚和β-細辛醚均迅速吸收進入體內并且消除較快，成分的體內變化趨勢與文獻報道相近[34-35]。在本研究中，兩者在達峰濃度（max）和曲線下面積（AUC）值的差異較大，推測其主要原因為復方中成分含量差異較大。文獻報道[34]大鼠ig石菖蒲揮發油提取物后α-細辛醚和β-細辛醚的max分別為（1.42±0.18）、（1.58±0.18）h，而本研究中大鼠ig開心散后α-細辛醚和β-細辛醚的max分別為（0.26±0.12）、（0.21±0.05）h，這提示開心散配伍可能促進α-細辛醚和β-細辛醚吸收。

去氫土莫酸與松苓新酸均為羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜，其藥動學過程存在相似性，即呈現消除緩慢的現象。Zhang等[36]進行了茯苓醇提物的成分藥動學研究，結果顯示去氫土莫酸為單峰吸收，而本研究中去氫土莫酸體內過程呈現雙峰現象，這與Xiao等[37]研究中顯示去氫土莫酸在茯苓提取物給藥后單峰吸收、制劑給藥后呈現雙峰吸收結果相近，推測這一結果可能是由于肝腸循環[38]。本研究中松苓新酸的體內過程呈現單峰吸收、消除緩慢的現象，與文獻報道[36,38]相近。另外，開心散中去氫土莫酸的含量是松苓新酸的15.8倍，但是去氫土莫酸和松苓新酸的max值接近，這一結果提示松苓新酸可能為更易被吸收的成分，值得關注。

茯苓新酸A和茯苓新酸B均為3,4-開環-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜，ig開心散后，2成分均被迅速吸收入血并且消除較慢，與文獻報道[36,38]相近。復方中，這2種成分的含量相近，但茯苓新酸B的max值、AUC值、平均滯留時間（MRT）值等參數均高于茯苓新酸A，這一結果提示茯苓新酸B可能更易被吸收入血，從而在體內發揮作用。另外，本研究結果顯示給藥開心散后松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B的達峰時間均低于文獻報道[36]中給予茯苓醇提物后各成分達峰時間，這提示開心散復方可能促進茯苓三萜酸類成分吸收。

綜上所述，本研究建立了同時測定大鼠血漿中開心散主要成分含量的UPLC-MS/MS方法，并將該方法成功地應用于開心散在AD模型大鼠體內的藥動學研究。本研究明確了AD疾病狀態下開心散中α-細辛醚、β-細辛醚、去氫土莫酸、松苓新酸、茯苓新酸A和茯苓新酸B這6種成分的體內藥動學特征，為明確開心散的體內物質基礎提供參考，并為開心散的臨床應用以及后續研究提供借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 唐·孫思邈著, 馮文全審校. 備急千金要方[M]. 太原: 山西科學技術出版社, 2019: 275.

[2] 日·丹波康賴撰, 高文柱校注. 醫心方 [M]. 北京: 華夏出版社, 2011: 552.

[3] 明·許浚. 東醫寶鑒 [M]. 太原: 山西科學技術出版社, 2014: 36.

[4] 明·張介賓著. 景岳全書(下) [M]. 上海: 第二軍醫大學出版社, 2006: 1251.

[5] Cao C, Xiao J Y, Liu M Q,. Active components, derived from Kai-Xin-San, a herbal formula, increase the expressions of neurotrophic factor NGF and BDNF on mouse astrocyte primary cultures via cAMP-dependent signaling pathway [J]., 2018, 224: 554-562.

[6] Wang N, Jia Y M, Zhang B,. Kai-Xin-San, a Chinese herbal decoction, accelerates the degradation of β-amyloid by enhancing the expression of neprilysin in rats [J]., 2020, 2020: 3862342.

[7] Yi P J, Zhang Z Y, Huang S Q,. Integrated meta-analysis, network pharmacology, and molecular docking to investigate the efficacy and potential pharmacological mechanism of Kai-Xin-San on Alzheimer’s disease [J]., 2020, 58(1): 932-943.

[8] Nishiyama N, Zhou Y, Takashina K,. Effects of DX-9386, a traditional Chinese preparation, on passive and active avoidance performances in mice [J]., 1994, 17(11): 1472-1476.

[9] 王彬斌, 馮曉曉, 恩特扎爾·別爾克, 等. 開心散對APP/PS1小鼠神經炎癥和Aβ沉積的作用研究[J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7511-7519.

[10] 韓國柱. 中草藥藥代動力學 [M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 1999: 3-7.

[11] Wang W, Liao Q P, Quan L H,. The effect ofon the bioavailabilities and brain concentrations of ginsenosides Rg1, Re and Rb1after oral administration of Kai-Xin-San preparations in rats [J]., 2010, 131(2): 313-320.

[12] Wang X T, Zhang Y, Niu H B,. Ultra-fast liquid chromatography with tandem mass spectrometry determination of eight bioactive components of Kai-Xin-San in rat plasma and its application to a comparative pharmacokinetic study in normal and Alzheimer’s disease rats [J]., 2017, 40(10): 2131-2140.

[13] Zhang X W, Li Q, Lv C X,. Characterization of multiple constituents in Kai-Xin-San prescription and rat plasma after oral administration by liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry [J]., 2015, 38(12): 2068-2075.

[14] Lv C X, Li Q, Zhang X W,. Simultaneous quantitation of polygalaxanthone III and four ginsenosides by ultra-fast liquid chromatography with tandem mass spectrometry in rat and beagle dog plasma after oral administration of Kai-Xin-San: Application to a comparative pharmacokinetic study [J]., 2014, 37(9/10): 1103-1110.

[15] Lv C X, Li Q, Zhang Y W,. A UFLC-MS/MS method with a switching ionization mode for simultaneous quantitation of polygalaxanthone III, four ginsenosides and tumulosic acid in rat plasma: Application to a comparative pharmacokinetic study in normal and Alzheimer’s disease rats [J]., 2013, 48(8): 904-913.

[16] 巴寅穎, 姜艷艷, 劉洋, 等. 基于遠志酮在記憶障礙模型大鼠體內藥代動力學特性的遠志及開心散藥物屬性研究 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2012, 35(8): 549-553.

[17] 巴寅穎, 姜艷艷, 劉洋, 等. 基于3,6′-二芥子酰基蔗糖在記憶障礙模型大鼠體內表征的單體、遠志及其經典方開心散藥代動力學 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2012, 18(14): 138-142.

[18] 巴寅穎, 姜艷艷, 吳霞, 等. 基于西伯利亞遠志糖A5、A6體內表征的開心散與遠志及單體藥代動力學關聯分析 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2015, 38(10): 703-708.

[19] Cao C, Xiao J Y, Liu M Q,. Active components, derived from Kai-Xin-San, a herbal formula, increase the expressions of neurotrophic factor NGF and BDNF on mouse astrocyte primary cultures via cAMP-dependent signaling pathway [J]., 2018, 224: 554-562.

[20] Zhu Y, Chao C, Duan X Z,. Kai-Xin-San series formulae alleviate depressive-like behaviors on chronic mild stressed mice via regulating neurotrophic factor system on hippocampus [J]., 2017, 7(1): 1467.

[21] Zhu Y, Duan X Z, Cheng X X,. Kai-Xin-San, a standardized traditional Chinese medicine formula, up-regulates the expressions of synaptic proteins on hippocampus of chronic mild stress induced depressive rats and primary cultured rat hippocampal neuron [J]., 2016, 193: 423-432.

[22] Smriga M, Saito H, Nishiyama N. Hoelen (Wolf) and ginseng (C. A. Meyer), the ingredients of a Chinese prescription DX-9386, individually promote hippocampal long-term potentiation[J]., 1995, 18(4): 518-522.

[23] Wang B B, Feng X X, Liu S H,. Comprehensive quality assessment of Kaixin Powder by HPLC-DAD quantification and HPLC-QTOF-MS/MS confirmation [J]., 2021, 6(17): 11319-11326.

[24] Wang X Y, Sun G Q, Feng T,. Sodium oligomannate therapeutically remodels gut microbiota and suppresses gut bacterial amino acids-shaped neuroinflammation to inhibit Alzheimer’s disease progression [J]., 2019, 29(10): 787-803.

[25] Zhao N N, Sun C X, Zheng M,. Amentoflavone suppresses amyloid β1-42neurotoxicity in Alzheimer’s disease through the inhibition of pyroptosis [J]., 2019, 239: 117043.

[26] George Paxinos, Charles Watson. 大鼠腦立體定位圖譜 [M]. 諸葛啟釧主譯. 北京: 人民衛生出版社, 2005: 2-9.

[27] Facchinetti R, Bronzuoli M R, Scuderi C. An animal model of Alzheimer disease based on the intrahippocampal injection of amyloid β-peptide(1-42) [J]., 2018, 1727: 343-352.

[28] Xiong W, Zhao X Q, Xu Q,. Qisheng Wan Formula ameliorates cognitive impairment of Alzheimer’s disease rat via inflammation inhibition and intestinal microbiota regulation [J]., 2022, 282: 114598.

[29] Yi P J, Zhang Z Y, Huang S Q,. Integrated meta-analysis, network pharmacology, and molecular docking to investigate the efficacy and potential pharmacological mechanism of Kai-Xin-San on Alzheimer’s disease [J]., 2020, 58(1): 932-943.

[30] 畢婷婷, 戰麗彬, 張櫟婧. 基于中藥整合藥理學平臺探究開心散治療AD的物質基礎與作用機制 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(16): 135-141.

[31] Scheltens P, de Strooper B, Kivipelto M,. Alzheimer’s disease [J]., 2021, 397(10284): 1577-1590.

[32] Hodson R. Alzheimer’s disease [J]., 2018, 559(7715): S1.

[33] Faborode O S, Dalle E, Mabandla M V. Exposure to footshock stress downregulates antioxidant genes and increases neuronal apoptosis in an Aβ(1-42) rat model of Alzheimer’s disease [J]., 2021, 150: 105170.

[34] Wang Z B, Wang Q H, Yang B Y,. GC-MS method for determination and pharmacokinetic study of four phenylpropanoids in rat plasma after oral administration of the essential oil ofSchott rhizomes [J]., 2014, 155(2): 1134-1140.

[35] 胡奎, 蘇夢, 徐鑫, 等. 石菖蒲揮發油β-環糊精、羥丙基-β-環糊精包合物在大鼠體內藥代動力學研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2017, 28(2): 187-190.

[36] Zhang J, Guo H M, Yan F L,. An UPLC-Q-Orbitrap method for pharmacokinetics and tissue distribution of four triterpenoids in rats after oral administration ofethanol extracts [J]., 2021, 203: 114237.

[37] Xiao F, Li Q, Liang K,. Comparative pharmacokinetics of three triterpene acids in rat plasma after oral administration ofextract and its formulated herbal preparation: GuiZhi-FuLing Capsule [J]., 2012, 83(1): 117-124.

[38] Qian Q, Zhou N, Qi P C,. A UHPLC-QTOF-MS/MS method for the simultaneous determination of eight triterpene compounds from(Schw.) Wolf extract in rat plasma: Application to a comparative pharmacokinetic study [J]., 2018, 1102-1103: 34-44.

Pharmacokinetic study of Kaixin Powder in rats with Alzheimer’s disease

FENG Xiao-xiao, WANG Bin-bin, CHEN Dong, QIU Feng, GONG Mu-xin, LI Zhao-xia

Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China

To characterize the pharmacokinetic behavior of the analytes of Kaixin Powder (開心散) in Alzheimer’s disease (AD) rats induced by oligomeric β amyloid protein 1-42 (Aβ1-42), and establish and verify an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method for simultaneous determination of components of Kaixin Powder in rat plasma.Rats model of AD was established by bilateral hippocampal injection of oligomeric Aβ1-42. Kaixin Powder was administered by single ig, blood was collected at different time points, and plasma concentrations of ingredients were determined. DAS 2.0 software was used to fit non-compartmental models to calculate pharmacokinetic parameters.The established UPLC-MS/MS method in terms of precision, accuracy, extraction recovery, matrix effect and stability and other methodological investigation results all met the determination requirements of biological sample analysis. The results of Morris water maze test confirmed that AD rats model was successfully constructed (< 0.05). After administration of Kaixin Powder, pharmacokinetic parameters of analytes with similar structure were similar, such as α-asarone and β-asarone belonging to isomers, dehydrotumulosic acid and dehydrotrametenolic acid belonging to lanosta-7,9(11)-diene type triterpenes, poricoic acid A and poricoic acid B belonging to 3,4-seco-lanostan-7,9(11)- diene type triterpenes.maxand1/2of α-asarone and β-asarone were short which showed a rapid absorption and elimination.maxof poricoic acid A and poricoic acid B were short but1/2of them were long, suggesting a rapid absorption and slow elimination;maxand1/2of dehydrotumulosic acid and dehydrotrametenolic acid were long, so the absorption and elimination rates of these compounds were slow. Moreover, dehydrotumulosic acid played a double-peak phenomenon and MRT of it was long. This might be caused by the enterohepatic circulation, and time of dehydrotumulosic acidcould be prolonged.Thepharmacokinetic process of the analytes of Kaixin Powder in AD rats is revealed, which can provide reference for clarifying theprocess of Kaixin Powder and its subsequent research and development.

Kaixin Powder; Alzheimer’s disease; pharmacokinetics; UPLC-MS/MS; oligomeric Aβ1-42; α-asarone; β-asarone; poricoic acid A; poricoic acid B; dehydrotumulosic acid; dehydrotrametenolic acid

R285.61

A

0253 - 2670(2022)14 - 4388 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.018

2022-03-07

北京市自然科學基金面上項目（7182019）；北京市青年拔尖人才培育計劃項目（CIT&TCD201504098）

馮曉曉，碩士研究生，研究方向為中藥體內過程和作用機制研究。E-mail: ccmufxx@163.com

李朝霞，副教授，研究方向為中藥體內過程和作用機制研究。E-mail: gmacli@ccmu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]