普通小麥4個主要矮稈基因的分子檢測

牟麗明，田秀苓，劉 丹，董亞超，何中虎

(1. 甘肅省定西市農業科學研究院,甘肅定西 743000; 2. 中國農業科學院 作物科學研究所,北京 100081)

株高是影響小麥生產潛力的重要農藝性狀，適當降低株高能夠增強小麥的抗倒伏能力，有助于提高收獲指數，促進高產穩產[1]。20世紀60年代，矮稈基因Rht1和Rht2的應用，促使了矮稈和半矮稈小麥品種的選育和推廣，極大地促進了全球小麥產量的增長[2-3]。

小麥中正式命名的矮稈基因有25個，但應用到育種中的卻很少，其中Rht1、Rht2、Rht8和Rht24應用最為廣泛[4-9]。Rht1和Rht2屬于赤霉素遲鈍型基因，來自于Norin10，降低株高15%，增產24%左右[5]。Rht1和Rht2分布廣泛，世界上70%的育成品種中至少含有其中一個矮稈基因[10]。Rht8和Rht24都屬于赤霉素敏感基因，其中Rht8來自于日本品種Akakomugi，降低株高10%，對產量無不利影響[11-14]；Rht24起源較早，在Norin10和Akakomugi中都能檢測到，降低株高6～8 cm，并且在世界小麥品種中分布廣泛，其中在國內小麥品種(系)中分布頻率約為84%，國外小麥品種(系)中分布頻率約為67%[5]。

分子標記輔助選擇是一種有效的技術手段，利用分子標記對小麥品種(系)進行分子檢測是開展分子育種工作的基礎。矮稈基因Rht1和Rht2已經通過同源克隆的方法被克隆，Ellis等[15]開發具有互補性質的STS標記，但在實際應用中因其特異性不足，并不能夠有效區分矮稈基因型和高稈基因型；隨著高通量KASP檢測平臺的建立，Rasheed等[16]根據Rht1和Rht2的基因序列開發KASP高通量功能標記，能夠準確、快速地檢測育種材料；隨后Tian等[5]也根據Rht1和Rht2的基因序列開發了檢測效果更好的CAPS功能標記。矮稈基因Rht8近期已被克隆，最初SSR標記Xgwm261常被用做檢測Rht8的有效分子標記，但該標記距離Rht8較遠且檢測出的變異類型較多[17-20]；隨著對Rht8研究的深入，Gasperini等[12]開發與Rht8共分離的分子標記DG273，擴增條帶391 bp代表矮稈類型， 421 bp代表高稈類型。Tian等[21]通過圖位克隆的方法克隆了矮稈基因Rht24并開發功能標記，可利用該CAPS標記TaCRY2對Rht24進行檢測。

為更好的了解現有小麥品種和骨干親本中矮稈基因分布，本試驗利用目前發布的最有效的矮稈基因分子標記對312份小麥材料進行檢測，為雜交組合的配制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與田間種植

共檢測小麥品種(系)312份，包括40份北部冬麥區材料、229份黃淮麥區材料和43份國外材料，其中63份材料于2018-2019和2019-2020年度種植于北京，中國農業科學院作物科學研究所東圃場，2 m行長，2行區，均勻撒播；將149份材料于2018-2019和2019-2020年度種植于中國農業科學院棉花所安陽試驗站，2 m行長，2行區，均勻撒播(附表1)。所有材料均由中國農業科學院作物科學研究所提供。

1.2 DNA提取

取苗期幼嫩的葉片0.2 g左右放入提前裝有鋼珠的2 mL離心管中，液氮迅速冷凍并用研磨儀(德國RETSCH MM400型)進行磨樣。采用CTAB法提取小麥基因組DNA[22]，利用紫外分光光度計檢測DNA濃度并調整至50 ng/μL，轉移至96孔中保存待用。

1.3 KASP檢測

矮稈基因Rht1和Rht2采用Rasheed等開發的KASP標記進行檢測(表1)。KASP標記共3條引物A、B和C，其中C為共用引物，A帶Fam熒光基團，激發藍光，檢測野生型，B帶Hex熒光基團，激發紅光，檢測突變類型。KASP反應體系為5 μL，主要包括DNA 1 μL(45 ℃烘干)，2.5 μL Master Mix (LGC，北京)，1.444 μL去離子水，0.056 μL混合引物(100 μmol/L的A、B、C工作原液按照A∶B∶C∶ddH2O = 12∶12∶ 30∶46的比例混合)。KASP反應程序采用Touchdown程序，起始退火溫度設定為65 ℃，每個循環下降0.8 ℃。采用KASP熒光掃描儀(Pherastar，LGC)進行結果掃描，用Kluster caller軟件進行基因分型。

1.4 PCR檢測

利用各分子標記對312份供試材料進行基因型檢測。矮稈基因Rht8采用共分離標記DG273進行檢測，Rht24采用CAPS標記TaCRY2進行檢測(表1)。PCR反應體系為15 μL，包括1.5 μL模板DNA，7.5 μL 2×TaqPCR Mix(天維，北京)，10 μmol/L上下游引物各1 μL，4 μL去離子水。PCR反應在BioRad公司(http://www.bio-rad.com)MyCycler PCR儀上完成，其反應程序為標準程序，DG273和TaCRY2的退火溫度分別為58 ℃和67 ℃。對TaCRY2標記的PCR產物進行酶切，酶切體系為10 μL，包括5 μL PCR產物，1 μL 10×緩沖液，0.2 μL限制性內切酶DpnⅡ(NEB，北京)，3.8 μL去離子水，37 ℃孵育3 h。在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳，200 V電泳45 min，在凝膠成像系統中波長為254 nm的紫外燈下觀察并拍照。

1.5 數據統計與分析

在小麥成熟期，分別測量安陽試驗點149份材料和北京試驗點63份材料的株高，株高為莖基部到穗頂端的距離(芒除外)。采用Excel 2010對數據進行統計。

表1 檢測矮稈基因的分子標記序列Table 1 Sequences of molecular markers for detection of dwarfing genes

2 結果與分析

2.1 4個主要矮稈基因檢測結果

利用Rht1和Rht2位點的KASP標記對供試材料進行檢測，若檢測結果是藍色(Fam)類型，則材料中含有高稈等位基因；若檢測結果是紅色(Hex)類型，則材料中含有矮稈等位基因；若檢測是粉色則代表無信號，針對粉色結果，進行二次檢測(圖1-A和1-B)。檢測結果顯示：在312份小麥品種(系)中，294份材料都至少含有一個“綠色革命”基因Rht1或Rht2，7份同時含有矮稈基因Rht1和Rht2，18份不含有這2個矮稈基因(表1)。

圖A和B分別為 Rht1和 Rht2位點檢測結果；黑點代表對照水，紅點代表矮稈等位基因類型，藍點代表高稈等位基因類型，粉色代表無信號；圖C和D分別為 Rht8和 Rht24位點檢測結果；M代表DL 2 000，泳道1～10分別是‘良星66’‘北京0045’‘中麥415’‘中麥996’‘泛麥8號’‘濟麥20’‘泛育麥17’‘CA14043’‘農大212’‘中麥895’

利用與Rht8共分離標記DG273對供試材料進行檢測，若擴增片段為421 bp，則表示該品種(系)含有Rht8矮稈等位基因；若擴增片段為391 bp，則表示該品種(系)含有Rht8高稈等位基因(圖1-C)。利用與Rht24緊密連鎖的CAPS標記TaCRY2對供試品種(系)進行檢測，含有Rht24矮稈等位基因品種(系)的擴增條帶275 bp會被酶切成233 bp和42 bp兩個條帶；不含有矮稈基因Rht24的品種(系)的擴增條帶275 bp不會被酶切開(圖1-D)。

2.2 4個矮稈基因及其組合分布頻率

在供試的312份品種(系)中，Rht1、Rht2、Rht8和Rht24的分布頻率分別為18.9%、 77.6%、50.0%和91.3%。在國內品種(系)中，Rht24的分布頻率(98.1%)最高，Rht2的分布頻率(83.6%)次之；在國外品種(系)中，Rht8的分布頻率(55.8%)高于Rht24(48.8%)、Rht1(39.5%)和Rht2(39.5%)。

大多數品種(系)中至少含有2個或2個以上的矮稈基因。2個矮稈基因組合分析結果顯示：Rht2+Rht24的分布頻率(73.4%)最高，隨后依次是Rht8+Rht24(45.5%)、Rht2+Rht8(35.9%)、Rht1+Rht24(15.7%)、Rht1+Rht8(12.2%)和Rht1+Rht2(2.2%)。在3個矮稈基因的組合中，Rht2+Rht8+Rht24分布頻率最高(33.7%)，然而，只有4份材料同時含有4個矮稈基因(表2)。

表2 312份品種(系)中矮稈基因及其組合分布頻率Table 2 Distribution frequency of dwarfing genes and their combinations in 312 varieties

2.3 不同麥區4個矮稈基因及其組合分布頻率

在本研究選用的國內276份冬小麥品種(系)中，北部冬麥區材料40份，黃淮麥區229份。Rht1在北部冬麥區的分布頻率(55.0%)高于黃淮麥區(8.7%)，Rht2在黃淮麥區的分布頻率(91.7%)高于北部冬麥區(37.5%)，Rht8在北部冬麥區的分布頻率(72.5%)高于黃淮麥區 (45.0%)，值得注意的是，Rht24在2個麥區的分布頻率都是最高的，其中40份北部冬麥區的品種(系)含有Rht24的品種(系)有39份；229份黃淮麥區品種(系)中，含有Rht24的品種(系)有225份。

由于Rht1+Rht2同時存在的頻率很低，因此不再分析該組合類型。在含不同矮稈基因組合中，Rht2+Rht24在黃淮麥區的分布頻率最高，占90.8%，Rht8+Rht24在北部冬麥區的分布頻率最高，占70.0%。由于Rht1在北部冬麥區的分布頻率高，而Rht2在黃淮麥區的分布頻率高，因此在矮稈基因的組合分布頻率中表現為Rht1+Rht8、Rht1+Rht24和Rht1+Rht8+Rht24在北部冬麥區的分布頻率高于黃淮麥區，而Rht2+Rht8、Rht2+Rht24和Rht2+Rht8+Rht24在黃淮麥區的分布頻率均高于北部冬麥區(圖2)。

2.4 不同矮稈基因及其組合對株高的影響

通過對供試材料4個主要矮稈基因(Rht1，Rht2，Rht8和Rht24)的檢測，結合兩年度其株高表型數據，對不同基因及組合對株高的效應進行了解析。不同矮稈基因和組合的株高在2個試驗點表現出類似的趨勢。在安陽試驗點149份材料中，Rht2的降稈效應最強，平均株高84.5 cm，Rht1的平均株高為90.2 cm；在含有2個矮稈基因的材料中，Rht2+Rht24的材料株高最矮，平均株高84.5 cm，Rht1+Rht24的材料株高最高，平均株高91.8 cm；含有3個基因時，Rht2+Rht8+Rht24材料的平均株高矮于Rht1+Rht8+Rht24的材料，這也反映出Rht2的降稈效應強于Rht1。在北京試驗點的63份材料中，在含有一個矮稈基因的材料中，Rht2的株高最低，為75.4 cm，Rht8的株高最高，為78.7 cm；在含有兩個矮稈基因的材料中，Rht2+Rht24組合類型株高最矮，為75.4 cm，Rht1+Rht8組合類型株高最高，為78.5 cm；在含有3個矮稈基因的材料中，Rht2+Rht8+Rht24組合類型的株高為 76.2 cm，低于Rht1+Rht8+Rht24組合類型，與安陽試驗點材料表現一致(表3)。

NCPWWR=Northern China Plain Winter Wheat Region; YHRVFWWR=Yellow & Huaihe River Valley Facultative Winter Wheat Region

表3 各基因型材料平均株高Table 3 Plant height under dwarf genes and their combinations cm

3 討 論

312份材料分子檢測結果分析表明，Rht24的分布頻率最高，廣泛存在于國內外小麥品種中，其次分別為Rht2、Rht8和Rht1。前人研究對黃淮麥區129份小麥材料進行分子標記檢測，發現含Rht8的材料最多(89份)，含Rht2的材料73份，含Rht1的材料37份。這與本研究結果略有不同，可能與供試材料的遺傳背景及分布區域有關[23]。在中國，來自不同麥區的冬小麥品種(系)矮稈基因的分布頻率不同，主要體現在Rht1、Rht2和Rht8上，此外，Rht1在北部冬麥區的分布頻率高，而Rht2在黃淮麥區的分布頻率高，這種現象可能與不同麥區最初所用的矮源有關。

在分析這4個矮稈基因的效應時發現，單獨含有某一矮稈基因的材料較少，很難對其進行單獨分析，各矮稈基因大多以組合的形式存在，這一方面是由于不同品種(系)所含矮稈基因類型和數目不同所造成的，另一方面可能與同一麥區矮稈背景相似有關[10]。同時，發現矮稈基因的降稈效應存在疊加特性，育種利用時需注意選配矮稈基因組合。值得注意的是，本研究發現矮稈基因Rht2無論是單獨存在，還是與其他基因互作，其降稈效應都稍強于其他幾個矮稈基因，這4個矮稈基因的降稈效應由強到弱依次為Rht2>Rht24>Rht8>Rht1,在前人研究中，Rht1和Rht2的降稈效應相差不大[24]，這可能與供試材料的遺傳背景相關，Rht8的降稈效應與前人研究相似[25]。另外，含有矮稈基因越多的材料其株高不一定最矮，譬如Rht1+Rht8+Rht24基因型材料的平均株高為84.1 cm，均高于這3個基因單獨存在時的株高，一方面可能與材料有關，另一方面可能由于矮稈基因間產生相互作用，導致株高發生變化。

分子標記開發是分子標記輔助選擇育種的基礎和關鍵。隨著標記開發技術的不斷發展，標記類型也不斷更新，由最初的STS和SSR標記逐漸發展為通量高、價格低的KASP標記。檢測Rht1和Rht2的標記，有最初的STS基因特異標記，也有后來開發的KASP和CAPS基因功能標記。針對同一基因開發不同類型的多個標記不僅為大家的檢測提供了多種選擇也可以使標記間得到相互驗證。