蘆筍AoAMS的表達及編碼蛋白與AoTDF1間的互作分析

扶艷艷，成 欽，聞 豪，劉正杰，林 春，黃 玲，楊煥文，毛自朝

(1.云南農業大學 農學與生物技術學院，昆明 650201；2.云南農業大學 特色小宗作物研究中心，昆明 650201；3.四川省農業科學院 經濟作物育種栽培研究所，成都 610300；4.云南農業大學 煙草學院，昆明 650201)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)是一種具極高的營養和保健功能的蔬菜，享有“蔬菜之王”、“世界十大名菜之一”等美譽[1]。當前中國雖已成為世界第一大蘆筍生產國和消費國[2]，但優質的蘆筍生產用種主要依靠進口，解除中國蘆筍產業可持續發展的限制因素是培育有自主知識產權的優良品種[3-4]。蘆筍是典型的雌雄異株植物，但其雄株因不結種子，營養消耗少，產品品質好，產量也比同期生長的雌株高出25%以上，且植株壽命長，抗性強，而受到廣大種植者的青睞，為此培育優質全雄蘆筍品種成為中國蘆筍育種家們的奮斗目標[5-6]。全雄蘆筍品種的培育可通過超雄株(MM)與雌株(mm)雜交獲得，因此優質超雄株的獲取便成為全雄品種培育的關鍵[7]。但又因蘆筍兩性株自交產生的超雄株存在自交衰退，而通過花藥培養獲得性狀優良的超雄株的方式也十分困難，且當前認為植物性染色體起源及性別分化的機制是植物雌、雄配子發育相關基因的突變及隨后同源重組修復抑制所導致的[8]，因此通過對蘆筍配子發育相關基因的功能研究，將實現獲取超雄種質的分子育種新途徑，同時也是解析蘆筍性別分化及性染色體起源的有效方法之一。蘆筍基因組測序組裝后的基因預測及突變體研究發現，AoTDF1是蘆筍雄株專一、且是Y染色體區的性別決定區域(MSY)的性別決定基因中的促雄基因[9-10]。但目前尚未有AoTDF1調控性別分化的分子機制及其下游調控靶基因的相關報道。筆者開展RNA原位雜交發現AoTDF1在蘆筍雄花雄蕊發育的早期階段表達水平高，而在雌花及雄花發育的晚期階段表達量低[11 ]，這與其同源的擬南芥TDF1基因的表達類似[12]；故推測蘆筍中與擬南芥AMS同源基因編碼蛋白應與AoTDF1互作，共同參與蘆筍花粉發育及性別分化的調控過程。

植物雄蕊花藥是雄配子發育的場所，其花藥壁由外至內由表皮層(epidermis)、內壁層(endothecium)、中層(middle layer)、絨氈層(tapetum)構成[13]。絨氈層作為花藥壁最內層的特殊分泌細胞，通過給發育中的花粉提供營養、發送調控信號等在雄配子發育中發揮著關鍵作用[13-14]。目前，在擬南芥中已經克隆出與絨氈層發育相關的多個轉錄因子，并且確定了1條包含5種轉錄因子的調控絨氈層發育的調控通路(DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1)[15-16]。在這些關鍵調控因子的研究中，Sorensen等[17]發現ABORTEDMICROSPORES(AMS)是編碼歸屬bHLH基因家族的MYC亞家族成員，調控絨氈層細胞發育及減數分裂后小孢子的發育。Xu等[18]和許杰等[19]以擬南芥ams突變體為材料系統地研究和分析了AMS基因在花藥發育過程中的作用，結果發現：ams突變體在四分體(tetrad)后絨氈層細胞異常的膨大，不能完成細胞程序性死亡過程(Programmed Cell Death，PCD)，最終導致花粉外壁發育異常。且AMS的功能發揮是通過特異識別其下游靶基因的啟動子中E-box順式元件，調控下游基因的表達[18-20]。Xu等[21]進一步研究發現AMS可調控孢粉素的生物合成以及花粉壁形成的前體物質的分泌。Ferguson等[22]研究發現AMS蛋白具雙時期(biphasic)表達與調控特征，表現為AMS蛋白的含量在花粉發育早期的絨氈層和花粉發育晚期的花粉外壁呈雙峰表達。目前在許多有花植物物種中已克隆鑒定了多個AMS的同源基因，其中水稻中OsTDR(TAPETUMDEGENERATIONRETARDATION)基因與擬南芥AMS同源，具相似的功能及表達模式[23-24]。劉辰[25]對辣椒同源基因CaAMS的功能分析表明，該基因沉默會導致植株部分花粉敗育，CaAMS在發育早期的花藥中表達。Sheng等[26]用甜瓜的雄性不育突變體ms-5為材料克隆了其AMS同源基因CsAMS。 Guo等[27]進一步發現辣椒CaAMS基因在絨氈層發育的四分體期和單核期強烈表達，且CaAMS表達下調會導致辣椒花絲縮短、皺縮、雄蕊不開裂，最終導致花粉敗育。袁巧玲[28]發現洋蔥的AcAMS定位于細胞核，且AcAMS基因具花藥表達特異性。辛琪琪[29]從白樺樹中克隆了BpAMS基因，亞細胞定位分析結果顯示其編碼蛋白定位在細胞核和細胞質中，qRT-PCR檢測野生型白樺的各個組織，發現在白樺雄花中的表達量明顯高于其他組織。這一系列研究預示AMS及其直系同源基因在物種演化中，其結構及功能都是相對保守的，因此推測蘆筍中與擬南芥AMS同源的蛋白，應與蘆筍AoTDF1互作，并且在蘆筍絨氈層發育調控中發揮相似的分子功能。

本研究通過同源性及進化分析初步預測到4條蘆筍的AMS同源基因，分別命名為AoAMS_L1、AoAMS_ L2、AoAMS_L3、AoAMS_L4。進一步利用轉錄組測序數據，對這4條候選基因進行表達量的分析，結果發現AoAMS_L1在蘆筍超雄株及兩性株的花蕾中表達量較高，而在雌株的花蕾以及兩性株的根、莖中表達量極低或不表達，說明AoAMS_L1基因在超雄株和兩性株的花蕾中專一地表達，故將AoAMS_L1基因作為首選基因進行進一步的研究。

紫蘆筍‘紫色激情’是四倍體，為富含花青素的“水果型甜蘆筍”，暢銷于國內外。因四倍體紫蘆筍的花蕾比普通二倍體蘆筍花蕾大，加之本研究組多年的連續的篩選與培養獲得了特殊的‘紫色激情’兩性株材料，目前已通過該材料連續自交3代獲得的兩性株，雌株、雄株材料[30]，用于蘆筍花器官變異的識別及配子調控基因的原位表達分析。為此，筆者通過RT-PCR擴增‘紫色激情’中AoTDF1和AoAMS的全長編碼序列(CDS)，開展AoAMS亞細胞定位，與AoTDF1的互作，以及AoAMS基因在紫蘆筍雌、雄以及兩性株中早期花蕾發育階段的花器官表達分析的研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 荷蘭綠蘆筍‘CIJNLIM’品種的雙單倍體(DH，Double Haploid)雌株和超雄株的花蕾轉錄組數據來自NCBI(National Center for Biotechnology Information )網站SRA數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR1642913)。本研究用的主要材料為3 a生‘紫色激情’(Purple passion)四倍體蘆筍兩性株自交后代的兩性株、雌株、雄株，種植于云南農業大學后山農場基地(海拔1 886 m；經度102°75′；緯度25°13′)。

于蘆筍開花期分別采集云南農大后山農場種植的紫蘆筍‘紫色激情’品種兩性株自交后代群體中的兩性株和雌株的幼嫩根、嫩莖和花蕾，做好標記后迅速用液氮冷凍，隨后保存在超低溫-80 ℃冰箱用于轉錄組測序。云南農業大學特色小宗作物研究中心實驗室培養的二倍體綠蘆筍‘Italy’品種的雌株組培苗用于蛋白亞細胞定位分析。采集云南農大后山農場種植的紫蘆筍‘紫色激情’品種兩性株自交后代群體中的雌、雄和兩性株早期花發育(T1～T3時期)的花蕾(其中T1：花蕾長度<1 mm，處于無雌雄發育差異的兩性階段；T2：1 mm≤花蕾長度<2 mm，處于性別發育的早期；T3：2 mm≤花蕾長度<3 mm，處于性別發育的晚期階段)，每個時期大約采 20 個花蕾放入新鮮配制的 FAA 固定液(每100 mL含 50%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、40%甲醛5 mL、甘油5 mL)中進行固定，隨后放入4 ℃冰箱保存，用于組織RNA原位雜交試驗。

1.1.2 菌株、載體及本研究中所用引物 菌株：大腸桿菌菌株(E.coli)DH5 α、農桿菌EHA105為本實驗室保存；酵母菌株Y2H gold由中國科學院熱帶植物資源可持續利用重點實驗室提供。

載體：植物瞬時表達載體pBI121-eGFP為本實驗保存，酵母雙雜交載體pGBKT7和pGADT7由中國科學院熱帶植物資源可持續利用重點實驗室胡彥如博士提供，酵母雙雜交陰性、陽性對照載體由廣州大學分子遺傳與進化創新研究中心陳麗玉博士贈送。

所有引物均用DNAMAN軟件設計，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物詳細信息見表1。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.2 方 法

1.2.1AoAMS基因的篩選與分析 從phytozome 數據庫網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲取蘆筍基因組注釋的蛋白序列，與NCBI(https://www.ncbi.nih.gov)下載的AMS蛋白序列(NP_179283.2)，進行blastp比對，并設置E-value <0.000 001，篩選同源性大于40%，且氨基酸長度大于100的AoAMS氨基酸序列作為候選基因。用同樣的方法得到了與蘆筍同屬物種文竹、大理天門冬以及茄科的馬鈴薯和番茄的AMS基因的氨基酸序列。用RaXML[31]軟件將所獲得的AMS同源候選基因的氨基酸序列與部分已鑒定基因功能的AMS基因的氨基酸序列以及文竹、大理天門冬、番茄、馬鈴薯的序列進行極大似然估計法(Maximum Likelihood Estimate，MLE)聚類構建系統發育樹。

基因表達量的分析用的是筆者實驗室開展的18個‘紫色激情’和6個荷蘭‘GIJNLIM’品種蘆筍樣本的RNA測序數據(‘紫色激情’RNA測序數據數據未發表)，分別經fastqc和fastp 質控和數據清洗后[32]，得到Clean date；再利用hisat2[33]比對到參考基因組中獲得短序列比對圖譜(SAM)文件，最后用R中的Rsubread包(https://bioconductor.org/packages/ Rsubread/)提取單個樣本中基因的表達量，并進行AMS候選基因表達量(Transcript Per Million Mapped Fragments,TPM)的統計分析。

1.2.2 亞細胞定位 利用在線程序(WoLF PSORT http://www.wolfpsort.org/)預測AoAMS編碼蛋白的亞細胞定位。進一步利用限制性內切酶XhoI和SpeI雙酶切pBI121-eGFP載體，獲得線性化載體，分別設計含SalI和XbaI的AoAMS:eGFP-F和AoAMS:eGFP-R引物 ，其中AoAMS:eGFP-R反向引物刪除終止密碼子并加上1個編碼短肽“GlyGlyGlyAla”的linker： GGG GGA GGG GCA(見表1，黑體部分顯示的是linker的反向互補序列)PCR擴增目標片段，擴增產物經SalI和XbaI雙酶切后，插入pBI121-eGFP載體XhoI和SpeI酶切位點的位置，隨后轉入DH5a感受態細胞中，挑取陽性克隆進行菌液PCR以及酶切驗證，驗證正確后命名為pBI121-35S:: AoAMS -eGFP。 將pBI121-AoAMS:eGFP與空載pBI121-eGFP分別轉化到農桿菌 EHA105 感受態細胞中，然后利用農桿菌侵染法侵染蘆筍‘Italy’品種雌株無菌苗的幼嫩莖段，具體實驗操作參考張園博士的蘆筍遺傳轉化方法[34]，同時設空載質粒pBI121-eGFP 為陰性對照。侵染完成后，將侵染后的蘆筍莖段平鋪在MS共培養基(MS + 1.0 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA + 2.0 mg/L 2,4-D +蔗糖 3% + 瓊脂粉0.6% + 200 mg/L Carb + 150 μmol/L AS)上于 19 ℃黑暗共培養 3 d后，使用激光共聚焦顯微鏡(OLYMP FV 1000)觀察熒光蛋白信號的產生。

1.2.3AoAMS在蘆筍雌、雄兩性花中的原位雜交檢測 紫蘆筍雌、雄及兩性株T1～T3時期的花蕾樣品均用FAA固定液(每100 mL FAA固定液包含：50%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、40%甲醛5 mL、甘油5 mL)固定后，經梯度酒精(50%、60%、70%、80%、90%、100%)每次20 min脫水，用透明溶液(1∶1無水乙醇/二甲苯混合液，二甲苯，二甲苯)各自浸泡30 min，之后換純蠟酸浸泡2次，每次2 h，完成透明；透明材料包埋后切片，切片厚度約15～20 μm。選擇AoAMS序列中特異性高的區域，設計探針引物(見表1:AoAMS-ISH-F/AoAMS-ISH-R)。用德國Roche公司的DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒，并按照說明書的步驟進行探針標記和組織原位雜交。

1.2.4 酵母雙雜交互作分析 設計AoTDF1和AoAMS基因編碼區的5′和3′引物：AoTDF1-Y2H-F/AoTDF-Y2H-R、AoAMS-Y2H-F/AoAMS-Y2H-R，引物序列見表1。通過PCR擴增分別在AoTDF1和AoAMS的CDS的5′端和3′端引入EcoRI和BamHI酶切位點后，用EcoRI和BamHI雙酶切，并插入pGBKT7和pGADT7相同的酶切位點處，而分別獲得AoTDF1-BD、AoAMS-BD與AoTDF1-AD、AoAMS-AD表達載體。Y2H gold酵母感受態的制備及轉化參照北京酷萊博Coolaber科技有限公司酵母感受態制備與轉化試劑盒(Super Yeast Transformation Kit)說明書。同時轉化陽性對照(53-BD與T-AD)和陰性對照(Lam-BD與T-AD、BD與AD)。把共轉化的酵母懸浮細胞涂布到二缺培養基(SD/-Leu/-Trp，百思禾Bestplant產品，南京)上，30 ℃培養2～4 d。待SD/-Leu/-Trp培養基上長出單菌落后，選取生長較好的酵母單克隆于加裝有 100 μL 無菌水的 EP 管中混勻，吸取 10 μL 置于四缺培養基(SD/-Leu/-Trp/ Ade/-His，百思禾Bestplant產品，南京)上，30 ℃繼續培養 2～3 d 后觀察酵母生長情況以確定蛋白間的互作。

2 結果與分析

2.1 蘆筍AoAMS基因的篩選與分析

NCBI 上下載的AMS蛋白序列進行Blastp比對，在蘆筍中篩選出4條同源性最高的AoAMS蛋白序列后，分別命名為AoAMS_L1、 AoAMS_L2、 AoAMS_L3、AoAMS_L4。利用RaXML軟件(https://github.com /stamatak/standard-RAxML/)將4條AoAMS候選基因的氨基酸序列與部分已鑒定基因功能的AMS基因的氨基酸序列、以及文竹、大理天門冬、番茄、馬鈴薯的序列進行極大似然估計法(Maximum Likelihood Estimate，MLE)聚類構建系統發育樹。結果顯示：AoAMS_L3與AoAMS_L4獨立的聚為一支，與已鑒定功能的其他物種的同源序列親緣關系較遠；AoAMS_L1與同屬的文竹(AsparagussetaceusJessop)以及大理天門冬(Asparagustalinensis)中的同源序列聚為一支，且與已確定基因功能的單子葉植物中的水稻(OryzasativaL.)、洋蔥(AlliumcepaL.)的同源序列關系相對較近。而 AoAMS_L2則與雙子葉植物中的辣椒(CapsicumannuumL.)、大麻(CannabissativaL.)、馬鈴薯(SolanumtubersumL.)中的同源序列親緣關系相對較近(圖1-A)。為進一步確定蘆筍中AMS的候選同源基因，分析了4個AoAMS候選基因在荷蘭‘CIJNLIM’蘆筍品種雙單倍體雌株和超雄株以及‘紫色激情’(‘Purple passion’)蘆筍品種兩性株自交后代的兩性株(A)和雌株(F)中不同器官組織的表達變化。結果發現： AoAMS_L1在荷蘭蘆筍品種‘CIJNLIM’的雙單倍體(DH)的超雄(SM)花蕾、以及蘆筍‘紫色激情’品種(P)兩性株(A)的花蕾中表達量較高，但在雙單倍體(DH) 雌株和紫蘆筍雌株的花蕾(F)、以及不同性別紫蘆筍的根和莖中表達量均較低；AoAMS_L2在所有檢測的組織和器官中表達均低； AoAMS_L3除在蘆筍的莖，雌株的花蕾中有一定的表達外，在其他器官組織中表達較低或無表達；AoAMS_L4除在根中表達較低外，在所有組織中均有較高表達(圖1-B)。因AoAMS_L1是唯一的在雄性和兩性株花蕾中專一表達的AMS同源基因，另進化樹分析它與已鑒定功能的其他物種的AMS基因親緣關系最近(圖1-A)，故將定位于7號連鎖群的AoAMS_L1(AsparagusV1_07.2467)命名為AoAMS，并進行蛋白的亞細胞定位、與AoTDF1的互作以及在花早期發育時期花蕾中不同器官的表達分析。

圖B中AoDH_F_F 是荷蘭蘆筍GIJNLIM品種 雙單倍體雌株花蕾；AoDH_SM_F是荷蘭蘆筍CIJNLIM品種 雙單倍體超雄花蕾；AoP_A_F 是‘紫色激情’品種兩性株的花蕾；AoP_A_R是‘紫色激情’品種兩性株的根；AoP_A_S是‘紫色激情’品種兩性株的莖；AoP_F_F 是‘紫色激情’品種雌株的花蕾；AoP_F_R是‘紫色激情’品種雌株的根；AoP_F_S是‘紫色激情’品種雌株的莖

2.2 AoAMS蛋白亞細胞定位分析

以AoAMS蛋白序列在WoLF PSORT網站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預測，結果顯示該蛋白可能定位于細胞核。通過農桿菌(EHA105)介導法分別將pBI121-GFP與重組pBI121-35s::AoAMS-GFP植物表達載體(圖2-A)導入二倍體綠蘆筍‘Italy’品種雌株組培苗的幼嫩莖段細胞中進行瞬時表達，于共焦距熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白( Green Fluorescent Protein ,GFP)與融合蛋白AoAMS-GFP的定位情況(圖2-B～2-G)。結果顯示：對照空載體GFP的熒光信號在細胞核、細胞膜、細胞質中均能檢測到，而AoAMS-GFP融合蛋白的綠色熒光信號主要集中發生在細胞核中，證實了AoAMS蛋白定位與預測結果相一致，且該結果與AoAMS作為轉錄因子的定位特征相一致。

Bright-field:明場；GFP：綠色熒光信號；Merge：疊加圖像，Bar=20 μm

2.3 AoTDF1與AoAMS蛋白的互作分析

AoTDF1和AoAMS的CDS 通過PCR擴增后，經EcoRI和BamHI雙酶切后，分別連接到酵母表達載體pGBKT7、pGADT7 的相同酶切位點上，經酶切鑒定確定連接正確后，將這些重組載體進行測序分析，確定AoTDF1和AoAMS在構建過程中未發生突變，此時說明已成功構建了酵母醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH1)啟動子啟動AoTDF1-BD，AoTDF1-AD、AoAMS-BD和AoAMS-AD融合表達的載體(圖3-A)。試驗組和對照組質粒分別轉入Y2H Gold酵母感受態細胞中，2～3 d后觀察發現：所有對照組及試驗組的酵母菌落在二缺培養基(SD/-Leu/-Trp)上都能正常生長，表明轉化成功。進一步通過觀察四缺培養基(SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His)上試驗組與對照組的酵母菌落生長情況判斷AoTDF1是否與AoAMS直接互作(圖3-B)。結果是共同轉化陰性對照組Lam-BD與T-AD、BD與AD、AoTDF1-BD與AD、AoAMS-BD與AD質粒的酵母菌落在四缺培養基上不能生長；而共同轉化AoTDF1-BD與AoTDF1-AD、AoTDF1-BD與AoAMS-AD、AoAMS-BD與AoAMS-AD、AoAMS-BD與AoTDF1-AD質粒的菌落，與共同轉化陽性對照53-BD/T-AD質粒的菌落在四缺培養基上均能正常生長，但轉化AoTDF1-BD與AoTDF1-AD、AoAMS-BD與AoAMS-AD質粒的酵母菌落要比轉化AoTDF1-BD與AoAMS-AD、AoAMS-BD與AoTDF1-AD質粒的酵母菌落相對較小。結果表明：在酵母中AoTDF1與AoAMS存在互作，且AoTDF1、AoAMS蛋白能夠自激活形成同源二聚體，預示AoTDF1、AoAMS可能是以不同亞基組合形式形成復合物來調控花藥絨氈層及花粉的發育。

圖3 AoTDF1與AoAMS表達載體構建(A)以及互作驗證(B)Fig.3 Construction of expression vector of AoAMS and AoTDF1(A)and interaction validation(B)

2.4 蘆筍AoAMS基因在蘆筍花發育早期階段的花器官中的表達

通過轉錄組測序數據分析，確定AoAMS主要在蘆筍雄株和兩性株的花蕾中表達(圖1-B)，但尚不知其在花蕾不同發育時期的花器官定位表達情況，而組織RNA原位雜交分析，將獲得AoAMS基因在蘆筍不同性別花發育的前3個時期的空間表達情況。試驗結果顯示：AoAMS基因在紫蘆筍雄花發育的T1期(無性別分化期)的絨氈層和花粉中表達較低，但花被中表達較強(紫色深淺代表表達量的高低， 圖4-A)，T2期(性別分化早期，圖4-B)的絨氈層、花粉以及花冠中均有較高表達，而到了T3期(性別分化晚期)AoAMS在花藥絨氈層中高效表達，但花被表達量下降(圖4-C)；而在T1、T2、T3期的雌花中檢測不到明顯的表達信號 (圖4-G～4-I)。兩性花蕾的原位RNA雜交分析發現：AoAMS在T1、T2期及T3期的花粉、絨氈層中均有高的表達信號(圖4-M～4-O)，但表達量T1>T2>T3期，但有趣的是在雄花衰退的雌蕊和兩性花正常發育的雌蕊中，也能檢測到AoAMS的表達信號(圖4-B、 4-C 、4-N、 4-O)。相應的sense-探針作為對照組的試驗中(圖4-D～4-F，4-J～4-L，4-P～4-R)均未檢測到雜交信號。以上結果說明AoAMS是雄配子正常發育所必須的，但與擬南芥AMS的表達相比，AoAMS基因在正?；ǚ郯l育的雄花與兩性花的雄蕊的花粉絨氈層中表達，但不具有擬南芥AMS花粉絨氈層專一性表達特征，在雄花和兩性花花被，甚至在兩性花正?；蛐刍ㄍ嘶l育的雌蕊中均有不同程度的表達。

A～C：雄花發育T1～T3時期；D～F：雄花加順式(Sence)探針對照；G～I：雌花發育T1～T3時期；J～L：雌花加順式(Sence)探針對照；M～O：兩性花發育T1～T3 時期；P～R：兩性花加順式(Sence)探針對照。bar=500 μm

3 討論與結論

植物避免自交衰退、保持遺傳新組合以適應環境變化的有效機制之一是性別分化。被子植物中有約160科的15 000個物種具有性別分化的現象，且發現這些物種的性別分化大約要經超過800余次的性別分化與性染色體獨立起源[8,35]。在兩性花植物分化為兩性株的過程中通常認為有雄性兩性花(androdioecy)和雌性兩性花(gynodioecy)的途徑，其中雄性兩性花途徑是物種群體中雌配子發育相關基因的失活導致雄株和兩性株共存，而雌性兩性花途徑是雄配子發育相關基因的突變導致雌株與兩性株共存。因雌性兩性花(gynodioecy)的途徑能較好地形成后代，與雄性兩性花途徑相比是主流的性別分化途徑。蘆筍作為典型的性別分化及性染色體起源較早的植株，是研究性別分化機制的優良材料[10,36]。

Daisuke等通過蘆筍基因組PCR分析，發現與擬南芥TDF1同源的AoMYB35/AoTDF1基因定位于蘆筍雄性專一Y染色體區(Male-specific region of the Y chromosome,MYS)僅在雄株中表達，Harkess等[10]2020年確定AoMYB35/AoTDF1是兩個性別決定基因之一的促雄發育基因，并且該基因在蘆筍雄花花粉及絨氈層中專一表達。預示蘆筍染色體起源及兩性分化應為雌性兩性株轉化(gynodioecy)途徑，因花粉發育關鍵基因AoTDF1的功能失活導致花粉敗育而形成雌株。為證實上述推測，需闡明AoTDF1是否參與花藥絨氈測發育的調控，及其是否與蘆筍AoAMS互作調控花粉及絨氈層的發育等。本研究首次通過同源比對，系統進化樹以及轉錄組測序后基因表達量的綜合分析，最終確定AoAMS_L1基因為蘆筍雄花或兩性花專一表達的AoAMS的候選基因(圖1)，進行亞細胞定位分析， 確定CaMV 35S 啟動子驅動AoAMS與GFP融合蛋白(AoAMS-GFP)后的熒光主要來源于細胞核(圖2-E～2-G)，而CaMV 35S 驅動GFP自身表達后沒有亞細胞專一性定位特征(圖2-B～2-D)，確定AoAMS是一個核定位特征蛋白。項目組前期用雙分子熒光互補分析(Bimolecular Fluorescence Complementation,BIFC)初步確定AoTDF1與AoAMS_L1有互作[11]，本研究進一步用酵母雙雜交方法獲得與BIFC方法相一致的AoTDF1與AoAMS互作，且AoTDF1和AoAMS自身也能互作的結果(圖3-B)。

AoAMS的擬南芥同源基因AtAMS在絨氈層發育和小孢子減數分裂后期發育及花粉壁的形成中起到關鍵的作用[18，21]。許杰等[19]通過基因表達譜芯片技術研究發現擬南芥AMS在減數分裂前表達量很低，但在減數分裂后表達量上升；為探究蘆筍AoAMS基因在不同性別花中的表達情況，經RNA原位雜交檢測，得知AoAMS基因是在蘆筍雄花發育的T2時期、T3時期的花粉、絨氈層中高效表達，而在T1時期(小孢子母細胞減數分裂期)表達較弱(圖4-A～4-C)。兩性花的AoAMS基因在花藥絨氈層，T1時期有較強的雜交信號，T2時期、T3時期信號較弱(圖4-M～4-O)。AoAMS基因在雌花發育早期的3個時期(T1時期、T2時期、T3時期)均無表達(圖4-G～4-I)。說明AoAMS確實是在雄花和兩性花的絨氈層中表達，但不具花藥絨氈層專一表達特性，說明AoAMS與AtAMS具相似功能，與AoTDF1一起調控花粉的發育，但長時間的物種演化形成了新AMS基因序列的變異或其非花藥絨氈抑制表達基因的失活而產生的表達模式或新的分子功能。值得注意的是雄花早期發育的花被中AoAMS的表達明顯高于兩性花，說明雌性的正常發育可能會抑制AoAMS基因在花被中的表達，但其調控機制還有待進一步的研究。擬南芥TDF1與AMS的互作復合物是花粉發育調控所必需的，且AtTDF1可直接通過與AtAMS啟動子AACCT順式元件結合而調控AMS及其下游調控通路如AtMYB103基因的表達[37]。為此進一步的工作將可參考擬南芥和水稻中花粉發育的遺傳調控通路，尋找AoAMS的下游調控基因，以及除AoTDF1外的互作蛋白及調控靶蛋白，進一步闡明AoAMS基因在蘆筍絨氈層發育調控通路中的分子功能。

AoAMS在蘆筍中與擬南芥AtAMS同源，其編碼蛋白定位于細胞核，與蘆筍性別決定促雄基因編碼蛋白AoTDF1有互作，在蘆筍早期發育的雄花和兩性花，而非雌花中表達的基因。預示AoAMS基因在蘆筍中發揮與擬南芥AMS相似的功能，其表達受AoTDF1的調控，與AoTDF1形成互作調控復合物，通過調控蘆筍花粉絨氈層和花粉發育相關基因的表達,在性別分化中發揮促雄的功能。