食管癌組織LOC100130476 基因的表達與預后的相關性分析

耿錦楠，張雅青，張 煦，陸 濱

（1.蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000；2.西北民族大學醫學部，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州市第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是在世界范圍最常見、多發的消化系統惡性腫瘤之一，有調查顯示，其致死率僅次于胃癌[1-2]。該病發病有明顯地區差異，約80%的食管癌發生于發展中國家[3]。我國是EC 高發國家，尤其多見于河南、山西、河北等省份，其中食管鱗狀細胞癌（Esophageal Squamous Cell Cancer，ESCC）占EC 的90%以上[4]。該病預后較差，病情進展至中晚期后患者的5 年生存率為10%～15%[5]。因此有必要尋找新的適用于ESCC 早期診斷及治療的分子靶點，以提高生存率，改善預后。LOC100130476 基因是一類位于人染色體6q23.3 的長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA），師雅斌等[6]對其在ESCC 中的表達及甲基化狀態進行研究，結果顯示，LOC100130476 在ESCC 中呈異常低表達，可能與該病的發生發展密切相關。但目前有關LncRNA LOC100130476 在ESCC中具體作用及其與預后的關系，國內外尚無相關報道。本研究采用RT-PCR 法檢測ESCC 患者癌組織及對應癌旁組織標本LOC100130476 的表達水平，進一步探討LOC100130476 在ESCC 組織中的表達情況、與臨床病理特征及預后的相關性，旨在為ESCC 的診斷和治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 一般資料 選取2014 年10 月—2016 年12 月蘭州大學第一醫院收治的食管鱗狀細胞癌（ESCC）手術患者70 例，均取原發灶及癌旁組織（距原發灶邊緣≥5 cm）標本，標本留取后于30 min 內置于液氮中并轉運至冰箱保存，經HE 染色確定為食管鱗狀細胞癌組織，癌旁組織未見癌細胞浸潤。手術切除采集組織標本后一部分于新鮮狀態下置于液氮冷藏，后入-80 ℃冰箱保存，供提取組織總RNA 及DNA，行RT-PCR 檢測；另一部分組織標本以10%福爾馬林固定并制作蠟塊保存，行HE 染色后觀察組織形態。70 例患者中男49 例，女21 例，年齡44～80歲，平均（61.59±10.32）歲。參考2017 年國際抗癌聯盟（UICC）和美國癌癥聯合會（AJCC）發布的食管癌分期標準（第7 版）[7]進行分期，依據世界衛生組織（WHO）病理分級標準[8]確定分化程度（1 級：高度分化；2 級：中度分化；3 級：低度分化）。以病歷回顧或電話隨訪等形式獲取所有患者臨床和預后資料。本研究經蘭州大學第一醫院醫學倫理委員會審核批準，且患者對實驗知情并簽署同意書。

1.1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）70 例患者經病理學證實為ESCC，行根治或姑息性切除術；（2）均為原發性食管鱗癌，術前未接受放化療治療；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）食管腺癌（EAC）患者；（2）心、肝、腎等重要臟器功能不全者；（3）合并自身免疫疾病或精神疾病者；（4）并發其他惡性腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器、試劑 實驗儀器：PCR 擴增儀（美國ABI 公司GeneAMP PCR）、微型離心機（賽洛捷克掌上離心機）、快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司，型號：XK96-A 型）、低溫冷凍離心機（上海精密儀器有限公司，型號：DL-6000B 型）、冷凍存貯冰箱（青島海爾，型號：HYC-940 型）、超低溫冰箱（青島海爾，型號：DW-86L386 型）等。實驗試劑：試劑（美國Invitrogen Life Technologies 公司）、反轉錄試劑盒（美國Invitrogen 公司）、SYBR Real-Time PCR 試劑盒（美國Thermo 公司）、PCR 引物（上海生工技術有限公司）、蛋白酶K（美國Ambion 公司）、胎牛血清（美國BI 公司）等。

表1 RT-PCR 引物序列及擴增條件

1.2.3 隨訪 出院后以上門和電話等形式隨訪，隨訪截止日期為2019 年12 月20 日。以手術開始至局部復發、遠處轉移或末次隨訪時間定義為無病生存期（Disease Free Survival，DFS），失訪或死亡為刪失值，以手術開始至任何原因死亡或末次隨訪時間定義為總生存期（Overall Survival，OS），分析其術后生存情況。

1.3 觀察指標

（1）組織標本HE 染色后觀察組織形態；（2）長鏈非編碼RNA LOC100130476 基因在ESCC 及癌旁組織中的表達水平；（3）長鏈非編碼RNA LOC100130476 基因表達與ESCC 患者臨床病理特征的關系分析；（4）長鏈非編碼RNA LOC100130476 基因表達與ESCC 患者生存情況的關系分析；（5）ESCC 不良預后危險因素分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 組織標本HE 染色結果

HE 染色結果顯示，所采集腫瘤標本均為ESCC 組織，其對應癌旁組織無癌細胞浸潤（圖1～2）。

圖1 正常食管鱗狀上皮組織（HE 200×）

圖2 ESCC 組織（HE 200×）

2.2 LOC100130476 在ESCC 及癌旁組織中的表達水平

RT-PCR 檢測結果顯示，ESCC 組織中LOC100130476 相對表達量下調，其表達量（0.79±1.62）顯著低于對應癌旁正常組織（2.89±2.77），差異有統計學意義（t=-5.475，P=0.000），見圖3。

圖3 LOC100130476 在ESCC 組織中表達明顯下調

2.3 LOC100130476 表達與ESCC 患者臨床病理特征的關系

ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達與腫瘤分化程度、T 分期和淋巴結轉移有關（P＜0.05），見表2。

表2 LOC100130476 表達與臨床病理特征的關系

2.4 LOC100130476 表達與ESCC 患者生存情況的關系

術后隨訪3 年，70 例患者生存29 例，占41.43%，死亡41例，占58.57%。LOC100130476 低表達組生存率低于高表達組（P＜0.05），患者DFS 和OS 均短于高表達組（P＜0.05），見表3。

表3 LOC100130476 表達與ESCC 患者生存情況的關系

2.5 危險因素分析

COX 多因素回歸分析顯示，LOC100130476 表達水平是影響ESCC 不良預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

表4 影響ESCC 患者不良預后的危險因素

3 討論

3.1 LncRNA 通過調控相關基因表達參與腫瘤的發生發展乃至浸潤轉移

LncRNA 是指長度在200～100 000 nt 之間，具有調控基因表達作用非編碼RNA 分子，其不編碼蛋白質，多以RNA 形式通過調控相關基因表達參與腫瘤的發生發展乃至浸潤轉移。目前人類已發現的LncRNA 多達11 萬種[9]，其在多種常見惡性腫瘤組織及細胞中呈異常表達（上調或下調），在ESCC 中異常表達的LncRNA 包括HOX 轉錄反義RNA、肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA1、前列腺癌上調長鏈非編碼RNA1、肝細胞核因子1 同源異形盒反義RNA1、邊緣系統相關膜蛋白反義RNA3、FOXC1 基因啟動子上游的轉錄體、尿路上皮癌胚抗原1、ENST000005479631.1 等。其中HOX 轉錄反義RNA 被證實在絕大多數ESCC 中呈異常表達，是癌細胞侵襲及轉移能力得以增強的重要驅動因素，同時也是影響患者預后的獨立危險因素[10]。

3.2 LncRNA LOC100130476 基因在多種腫瘤組織中發揮抑癌基因作用

LncRNA LOC100130476 是LncRNA 的重要成員，其位于染色體6q23.3，現有研究證實該基因有3 個CpG 島，長度分別為224、768、151 bp。師雅斌等[6]對LncRNA LOC100130476 在ESCC 中的表達情況進行了研究，結果顯示，LOC100130476 在ESCC 組織中的表達量明顯低于正常組織，提示其可能在ESCC中發揮抑癌基因的作用。此后相繼有研究發現，LncRNA LOC100130476 在胃賁門腺癌組織和腎細胞癌原發腫瘤組織中的表達低于對應癌旁正常組織[11-12]，這進一步提示LncRNA LOC100130476 可能在多種腫瘤組織中發揮抑癌基因作用，但其在ESCC 組織中的表達及導致其表達異常的機制尚不明確。本研究發現，ESCC 組織中LOC100130476 的表達顯著低于癌旁組織，提示其在ESCC 患者癌組織中表達下調，可能發揮抑癌基因作用，與既往研究結論一致[6]。更進一步的研究發現，ESCC組織中LncRNA LOC100130476 表達與腫瘤分化程度、T 分期和淋巴結轉移有關（P＜0.05），即低分化、T3 期和出現淋巴結轉移患者的ESCC 組織LncRNA LOC100130476 的表達水平相對更低，而LOC100130476 基因表達下調可能是ESCC 發生的機制之一，推測其作用機制與DNA 甲基化有關[13-15]。通常認為在腫瘤形成過程中包含遺傳學機制和表觀遺傳學機制，這兩種機制共同影響腫瘤形成，且相互交叉存在。DNA 甲基化是表觀遺傳學常見修飾形式，在腫瘤發生發展中可能發揮重要作用。基因啟動子區及第一外顯子區含CpG 島豐富的部位易出現甲基化，甲基化發生后可改變染色質結構，影響DNA 構象及穩定性，導致基因表達沉默，致抑癌基因表達下調，促進細胞增殖及分化，誘發腫瘤。

3.3 LncRNA LOC100130476 基因作為抑癌基因參與了ESCC 的發生發展

既往研究證實，結腸癌中抑癌基因表達下調，而恢復其表達可致腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖[16]。一方面，ESCC 中抑癌基因表達下調可能是腫瘤發生的重要機制；另一方面，抑癌基因可能作為判斷腫瘤患者預后的重要標記。Fan 等[17]經研究發現骨髓異常綜合征患者SOX7 基因啟動區CpG 島的甲基化率（達58.1%）顯著高于正常對照組，而該病進展至晚期后SOX7 甲基化率也顯著高于早期患者，認為SOX7 的表達及其甲基化狀態可能作為此類患者預后預測因子。師雅斌等[6]經研究指出ESCC 中LOC100130476 的甲基化可能是該病的特異性標志物，采用藥物改變其第一外顯子區甲基化狀態有望成為臨床治療該病的一種可行性策略。鑒于此，我們推測ESCC 組織中LOC100130476 可能也與患者預后相關。本研究發現，ESCC 組織中LOC100130476 低表達組生存率、DFS 和OS 均較高表達組差（P＜0.05），且其表達水平是影響患者不良預后的獨立危險因素（P＜0.05），推測LncRNA LOC100130476 低表達可能預測ESCC 預后不良。因此LOC100130476 可能在ESCC 的發生發展中發揮作用，且可作為預測臨床預后的分子指標。

3.4 LncRNA LOC100130476 基因可能是影響ESCC 預后的獨立危險因素

綜上所述，LncRNA LOC100130476 在ESCC 組織中較癌旁組織顯著下調，表達下調可能是ESCC 的發病機制之一，提示其可能作為抑癌基因參與了ESCC 的發生發展；LncRNA LOC100130476 在ESCC 組織中的表達水平是影響ESCC 患者預后的獨立危險因素。本研究主要存在以下不足：（1）樣本量較少，未就ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 基因甲基化狀態開展研究，這可能是闡述ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達下調的重要機制；（2）ESCC 組織中LncRNA LOC100130476 表達下調的具體機制仍有待進一步研究。