貴州喀斯特地區(qū)不同生境土壤放線菌的分布

周 娟，龍云川，周 偉，鄧春英，黃 霞，周少奇

(1.貴州科學院，貴州 貴陽 550001；2.貴州大學 資源與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550025；3.清華大學 環(huán)境學院，北京 100084)

自然界中的微生物資源豐富且廣泛分布于各種生境中，微生物資源能為農業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)提供所需的材料和能源。放線菌是微生物資源中不可或缺的一大類，在土壤生物地球化學循環(huán)和土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用。放線菌實際的應用價值和經濟價值都極其廣泛，在自然環(huán)境中能產生很多有活性的物質，如抗生素、酶及其抑制劑等。此外，放線菌能生產具有臨床和藥學重要性的新型先導化合物，在目前已知的1000種不同抗生素中，約70%是由放線菌生產的。近年來，更多新的活性物質從特殊生境微生物中分離純化出來，而作為活性物質新來源的放線菌受到了國際科學研究者的關注和重視。

貴州喀斯特地區(qū)復雜的地形、裂隙懸崖、溶洞和多變的氣候條件形成了多種生態(tài)系統(tǒng)，促進了生物多樣性的豐富程度。由于區(qū)域的自然條件和地理隔離具有一定的特殊性，不同生境條件下微生物的多樣性組成在一定程度上存在明顯差異。目前關于貴州喀斯特地貌不同生境放線菌的資源及多樣性研究相對較少，因此，本研究選取貴州西南喀斯特不同地區(qū)不同生境的土壤作為研究對象，對土壤中的放線菌進行分離、篩選、鑒定，通過分析考察不同生境中放線菌的分布和多樣性，為貴州地區(qū)的微生物資源現狀開發(fā)、保護和可持續(xù)利用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

分別從貴州興義萬峰林國家地質公園(104°55′24″E，25°59′17″N)、六盤水梅花山(104°33′52″E，26°44′56″N)、畢節(jié)威寧草海國家自然保護區(qū)(104°14′39″E，26°51′59″N)、畢節(jié)金沙縣(106°20′51″E，27°28′35″N)、遵義綏陽雙河洞(107°20′30″E，28°10′42″N)采集土壤樣品，采樣區(qū)域具體信息如表1所示。

表1 研究區(qū)域基本信息Tab.1 The basic information of the study areas

.研究方法

..土壤樣品的采集與制備

分別選取采樣區(qū)域不同生境土壤作為樣品來源，設置10 m×10 m樣方，采用五點法采集樣方內土壤，每個點采集3個不同樣品充分混勻作為該點土樣，采樣時將所采區(qū)域范圍的植被、落葉用取樣器刮除，離地表面5～20 cm深處用取樣器均勻取樣，剔除石礫、植被殘體等，將土壤樣品充分混勻，取部分裝進無菌自封袋帶回實驗室，及時冷凍干燥，研磨為均勻細小的顆粒，放于-20 ℃冰箱中標號保存以備用。

..放線菌的分離純化

將處理后的土壤樣品分別進行放線菌的分離純化。采用十倍梯度稀釋法制備土樣，選取10、10、103個稀釋濃度的土壤菌懸液，均勻涂布于改良后的高氏1號培養(yǎng)基平板上，為抑制土壤樣品中其他微生物的生長繁殖，確保分離得到放線菌，本研究在滅菌后的高氏1號培養(yǎng)基中添加了75 mg/L的無菌重鉻酸鉀。經28 ℃培養(yǎng)7～15天后，觀察各平板上菌落的長勢和色素分泌情況，挑取不同的單菌落進行多次分離純化，最后將純化菌株進行斜面保藏和甘油保存。

..放線菌的形態(tài)鑒定

將分離得到的放線菌菌株進行形態(tài)鑒定，觀察記錄菌株在高氏1號培養(yǎng)基上的形態(tài)、可溶性色素顏色、氣生和基內菌絲顏色、形狀等，在光學顯微鏡下觀察菌株菌絲體特征，參照《放線菌分類基礎》、《鏈霉菌鑒定手冊》將菌株鑒定到屬或鏈霉菌的類群。

..放線菌的16S rDNA序列分析

利用細菌DNA抽提試劑盒提取純培養(yǎng)放線菌的基因組，選用通用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)擴增放線菌的16S rDNA基因片段。基因擴增反應體系參照龍云川等方法進行。PCR擴增產物經電泳驗證后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因序列測定與分析。運用MEGA軟件通過Neighbor Joining方法構建放線菌各菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，并分析發(fā)育親緣關系。

2 結果與分析

2.1 典型放線菌菌株的形態(tài)特征

從貴州興義萬峰林國家地質公園、六盤水梅花山、畢節(jié)威寧草海國家自然保護區(qū)、畢節(jié)金沙縣、遵義綏陽雙河洞共采集土壤樣品25份，用梯度稀釋法分離純化得到放線菌菌株156株，部分放線菌的典型菌落形態(tài)如圖1所示。從圖1可以看出，不同種類的放線菌菌株的孢子顏色、氣絲顏色、基內絲體顏色存在一定差異，呈現白色、灰色、褐色、鮮黃色、橙紅色等多種顏色，部分放線菌菌株還可產生不同顏色的可溶性色素。

注：a為菌株511(鏈霉菌屬(Streptomyces)燼灰類群)；b為菌株531(鏈霉菌屬(Streptomyces)灰褐類群)；c為菌株542(鏈霉菌屬(Streptomyces)灰紅紫類群);d為菌株552(鏈霉菌屬(Streptomyces)灰褐類群)；e為菌株624(鏈霉菌屬(Streptomyces)淡紫灰類群)；f為菌株1091(非鏈霉菌屬)。圖1 典型放線菌菌落Fig.1 Typical actinomycetes colonies

部分放線菌的菌絲形態(tài)如圖2所示，圖2-a孢子絲較直，少數呈螺旋形或環(huán)狀，孢子呈柱形；圖2-b孢子絲松敞，呈規(guī)則螺旋形，孢子呈橢圓形，表面較光滑；圖2-c菌落致密，孢子絲呈緊密螺旋形，孢子多呈卵圓形，表面常有大突起。

注：a為菌株511；b為菌株552；c為菌株624。圖2 放線菌菌絲的典型形態(tài)Fig.2 Typical morphology of actinomycetes mycelia

綜上可知，不同種類的放線菌菌株的菌絲生長情況各異，有的菌株(圖1-e)菌絲致密,有的菌株(圖1-a)菌絲較為疏松。不同種類的放線菌孢子絲及孢子也形態(tài)各異(圖2)。

2.2 典型放線菌菌株的鑒定

基于放線菌單菌落在平板中的培養(yǎng)特征，對相同放線菌菌株進行歸類，挑選了25株代表性的菌株進行16S rRNA測序，得到放線菌菌株的分類學信息，如表2所示。分離得到的156株菌株分別鑒定為6個屬：游動放線菌屬()、小單孢菌屬()、諾卡氏菌屬()、類諾卡氏菌屬()、放線菌屬()、鏈霉菌屬()，分別屬于24個種和1個疑似新種。分離到18個不同種類的鏈霉菌屬放線菌，7種稀有放線菌(非鏈霉菌屬)。

表2 代表性放線菌菌株分類Tab.2 Taxonomic assignment of actinomycetes strains

2.3 不同生境對放線菌分布的影響

從各采集區(qū)域選擇1種代表性的生境土壤樣品進行生境對土壤放線菌分布的影響探究。不同生境中放線菌的分布如表3所示，采集地生境為荒地、山坡時，分離純化出的放線菌菌株數量和放線菌所屬的種類較少，采集地生境為濕地時，分離純化出的放線菌數量和種類最多，喀斯特洞穴中(綏陽雙河洞)次之。

表3 不同生境中放線菌的分布情況

2.4 放線菌的16S rDNA序列分析

在鑒定分離得到的放線菌菌株時，發(fā)現1個疑似新種(菌株L6152)，16S rDNA序列測定結果表明該基因片段大小為1463 bp。Blast分析結果顯示，該菌株的序列與枝鏈霉菌()相似度為97.5%。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示，菌株L6152與枝鏈霉菌(該菌株登陸號為KX462528)雖位于同一分支，但親緣關系較遠，故該菌株為疑似新種，暫命名枝鏈霉菌(sp.nov.)。菌株L6152從喀斯特洞穴綏陽雙河洞分離得到，該洞穴的特殊環(huán)境給新型放線菌的生存提供了有利條件。

圖3 基于16S rDNA序列分析構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

3 結論與討論

以貴州喀斯特地區(qū)不同生境的土壤為對象，開展放線菌微生物資源及其多樣性調查。在貴州興義市、六盤水市、威寧縣、金沙縣、綏陽縣等地采集土樣標本25份，共分離得到不同種類的放線菌菌株156株，分屬6個屬及25個種，其中有1個疑似新種，暫命名枝鏈霉菌(sp.nov.)。放線菌群落中鏈霉菌屬是占絕對優(yōu)勢的類群，廣泛分布于5個不同生境的土壤中。鏈霉菌因代謝物豐富多樣，具有很強的適應性；Long和D’Angeli的研究也證實了鏈霉菌屬在多種生境的土壤中具有較高的豐度，本研究與其研究結果基本一致。

本研究結果表明，在進行放線菌菌株分離及資源利用時，應結合不同種類放線菌的生長特性及采樣地生境特點。建議優(yōu)先選擇自然保護區(qū)和受人為活動干擾較少的區(qū)域，這有利于增加土壤放線菌的種類、數量以及發(fā)現稀有放線菌的概率。此外，本研究中稀有放線菌的種類和數量較少，這可能與采用的分離培養(yǎng)基種類較少有關。部分稀有放線菌有著獨特的適應環(huán)境與培養(yǎng)條件，例如某些放線菌偏好寡營養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境。

洞穴生境由于有機營養(yǎng)物質有限、無光照、濕度高等特點，是一類極端的生物棲息地。放線菌是細菌域中重要的門之一，在森林、農田等多種生境環(huán)境中都有發(fā)現。放線菌自身的代謝特點可以較好的適應洞穴生境的寡營養(yǎng)環(huán)境。本研究中發(fā)現洞穴生境中放線菌的分布較為豐富(綏陽雙河洞)，與該研究結果一致。

稀有放線菌在培養(yǎng)基中的恢復及生長過程需要各種類型的特殊環(huán)境條件，本研究所分離出的稀有放線菌的種類和數量較少。后續(xù)放線菌菌株分離及資源采集時，可針對放線菌的生長特性及采樣地生境特點，對分離培養(yǎng)基及分離條件進行針對性設計。本研究初步揭示了貴州喀斯特地區(qū)土壤微生物放線菌的分布，可為喀斯特區(qū)域放線菌的資源保護和開發(fā)利用提供科學數據。