豫北夏玉米根際2種根腐線蟲的形態和分子鑒定

胡瑤君 徐菲菲 任 航 夏艷輝 趙子堯 李 宇 李洪連 袁虹霞 王 珂

(河南農業大學 植物保護學院/小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002)

玉米是我國最重要的糧食作物之一，也是我國畜牧業、水產養殖業和化工業等產業的重要原料。河南省位于黃淮玉米優勢產業帶的中心區域，自然資源豐富，玉米種植面積和總產量均達到全國的10%。豫北地區地處黃淮海平原西部，光熱資源充足，是河南省夏玉米的主產區和高產區。玉米在生長過程中會受到多種病原物的危害，植物病原線蟲就是其中重要的病原物之一。據報道，植物線蟲侵染能夠使玉米的產量和品質嚴重受損，給世界農業生產造成極大危害。

短體屬線蟲(

Pratylenchus

Filipjev,1936)又稱根腐線蟲,是一類分布廣泛，種類繁多的遷移性植物內寄生線蟲，現已報道的有效種超過100個。根腐線蟲主要危害玉米的根系，其穿刺和取食寄主薄壁組織引起的傷口為其它病原菌的侵入提供便利，造成病害復合侵染，大大加重作物的受害程度。玉米是根腐線蟲危害的主要農作物之一，已有多種根腐線蟲危害玉米的報道。高學彪等的研究結果表明斯克里布納短體線蟲(

P.

scribneri

)在華北省區的玉米上發生普遍，該線蟲的侵染對玉米根系發育和地上部生長量影響顯著，但該研究缺乏根腐線蟲的分子鑒定數據；劉維志等對我國北方玉米主產區根寄生線蟲的種類進行了系統調查，在江蘇省玉米上發現有斯克里布納短體線蟲的發生危害，山東省玉米上有安地斯短體線蟲(

P.

andinus

)、角基短體線蟲(

P.

angularis

)和艾斯頓短體線蟲(

P.

cstconionsis

)的發生危害，遼寧省玉米上有咖啡短體線蟲(

P.

coffeae

)、斯克里布納短體線蟲、玉米短體線蟲(

P.

zeae

)、鈴蘭短體線蟲(

P.

cinvallarae

)、弗萊克短體線蟲(

P.

flakkedsis

)、六裂短體線蟲(

P.

hexincisus

)和盧斯短體線蟲(

P.

loosi

)的發生危害，這些根腐線蟲的侵染可造成植株的矮化和根系的腐爛；劉修勇等報道山東省玉米根部有艾倫短體線蟲(

P.

alleni

)、咖啡短體線蟲、六裂短體線蟲、落選短體線蟲、穿刺短體線蟲(

P.

penetrans

)和斯克里布納短體線蟲的發生危害；郭寧等的研究表明短體屬線蟲在河南省和遼寧省玉米根際發生普遍，為兩省區的優勢屬；Qiu等在山東省泰安市玉米根部分離出了斯克里布納短體線蟲和落選短體線蟲；Li等首次在內蒙古赤峰市玉米根際發現斯克里布納短體線蟲的發生危害；夏艷輝等在豫西和豫東的玉米根際發現斯克里布納短體線蟲和咖啡短體線蟲的侵染危害，但關于豫北地區玉米根際根腐線蟲發生與分布的報道較少。本研究擬從形態學和分子生物學兩方面對采自于豫北地區的2個根腐線蟲種群進行種類鑒定，旨在了解豫北地區玉米根腐線蟲的種類和分布情況，為今后玉米線蟲病害的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與線蟲分離

2020年9月，在河南省鶴壁市淇濱區劉寨村和焦作市武陟縣喬廟鎮宋陵村玉米田選取地上部矮小、長勢弱且根系腐爛變褐的玉米病株，采集其根系及根際土壤樣本備檢。將樣本根系剪碎后與根際土壤混勻，采用改良貝爾曼漏斗法分離根腐線蟲。

1.2 根腐線蟲的單雌擴繁

在體視顯微鏡下觀察分離到的根腐線蟲，依據形態特征分別從兩地市樣本中挑取8條雌蟲，經0.3%的硫酸鏈霉素溶液消毒8 h后，單雌接種在胡蘿卜愈傷組織上，25 ℃黑暗環境下培養3～5個月，最終得到了4個純化的鶴壁種群和5個純化的焦作種群。將采自于鶴壁市的純化種群記為HB-1種群，將采自于焦作市的純化種群記為JZ-257種群。胡蘿卜愈傷組織的制備參照Reise等的方法。

1.3 形態學鑒定

參照王碩等的方法進行線蟲的熱殺死和固定：在體視顯微鏡下挑取純化培養后的線蟲，置于帶有無菌水的凹玻片上，在酒精燈火焰上熱殺死并快速挑至40 μL FG固定液(4%)中固定。進行加速固定的PCR熱循環程序：95 ℃ 2 min，65 ℃ 10 min，75 ℃ 10 min，85 ℃ 10 min，95 ℃ 10 min，25 ℃終止反應，采用乙醇-甘油脫水法對固定的線蟲進行脫水并制作永久玻片。在尼康光學顯微鏡(Nikon Eclipse Ti-S)下進行線蟲的形態觀察和拍照，并按De Man公式對線蟲的形態特征進行測量。

1.4 分子鑒定

參照王江嶺等的蛋白酶K法提取單條線蟲DNA。使用高保真的KOD FX DNA聚合酶(TOYOBO)，以(D2A：5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′,D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)和(18S：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′,26S：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)為引物,分別擴增HB-1和JZ-257種群的rDNA 28S D2-D3區和rDNA-ITS區序列。PCR擴增、產物純化回收及連接轉化等參照夏艷輝等的方法進行。PCR檢測的陽性克隆菌液送公司測序，然后將所得序列在NCBI中進行BLAST比對。

1.5 系統進化樹的構建

采用MEGA 7軟件進行系統進化分析。根據BLAST比對結果從GenBank數據庫中下載序列相似性較高的根腐線蟲不同種及不同種群的rDNA 28S D2-D3區和rDNA-ITS區序列，使用Clustal W工具將本研究獲得的根腐線蟲序列與已下載的參考序列進行比對分析，基于鄰接法(Neighbor-joining)構建供試根腐線蟲與其它根腐線蟲rDNA 28S D2-D3 和rDNA-ITS區序列的進化樹，并采用自展法(Bootstrap method)對進化樹分支進行可信度評估。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

根據短體屬線蟲種類的鑒別特征：如側線數、唇區、口針長度、口針基部球形態和尾部形態等，對采自于豫北的2個根腐線蟲種群進行種類鑒定。基于形態特征觀察和形態測計值分析，并與Castillo等對短體屬不同線蟲種群的形態描述作比較，結果發現HB-1種群和JZ-257種群分別為斯克里布納短體線蟲和落選短體線蟲(圖1、圖2和表1)。

(b)標尺為2 μm，(c)、(e)～(h)和(j)～(m)標尺為10 μm，(d)標尺為15 μm，(a)和(i)標尺為20 μm。(a)和(i)線蟲整體；(b)唇區；(c)食道腺與腸重疊區及排泄孔；(d)陰門與后陰子宮囊；(e)側線和側區；(f)～(h)頭部；(j)～(m)尾部。(b) Scale bar=2 μm, (c)， (e)-(h) and (j)-(m) Scale bar=10 μm, (d) Scale bar=15 μm, (a) and (i) Scale bar=20 μm. (a) and (i) Entire body; (b) Lip region; (c) Anterior and pharyngeal overlap regin,excretory pore; (d) Vulval and Post-uterine sac region; (e) Lateral lines and lateral field; (f)-(h) Head; (j)-(m) Tail.圖1 根腐線蟲HB-1種群雌蟲形態Fig.1 Female morphology of Pratylenchus HB-1 population

(b)標尺為=4 μm，(c)～(e)標尺為10 μm，(a)和(f)～(m)標尺為20 μm。(a)和(m)線蟲整體；(b)唇區；(c)、(d)和(f)頭部；(e)陰門與后陰子宮囊；(g)食道腺與腸重疊區及排泄孔；(h)側線和側區；(i)生殖腺；(j)～(l)尾部。(b) Scale bar =4 μm, (c)-(e) Scale bar=10 μm, (a) and (f)-(m) Scale bar=20 μm. (a) and (m) Entire body; (b) Lip region; (c)， (d) and (f) Head; (e) Vulval and post-uterine sac region; (g) Anterior, pharyngeal overlap regin and excretory pore; (h) Lateral lines and lateral field; (i) Genital gland; (j)-(l) Tail.圖2 根腐線蟲JZ-257種群雌蟲形態Fig.2 Female morphology of Pratylenchus JZ-257 population

表1 鶴壁HB-1種群和焦作JZ-257種群雌蟲形態測量值
Table 1 Morphological measurements of females in Hebi HB-1 population and Jiaozuo JZ-257 populatio

形態測量值Morphometric valueHB-1種群HB-1populationRoman &Hirschmann(1969)JZ-257種群JZ-257populationLoof(1960)體長/μmBody length434.5±31.3(406.0～538.1)504.4±23.0(436.8～553.2)434.3±41.6(384.5～526.5)430.0(330.0～490.0)體長/最大體寬Body length/Greatest body width24.7±2.3(20.3～28.2)26.3±1.6(21.4～29.0)23.2±1.8(20.6～26.6)22.5(20.5～26.4)

表1(續)

形態測量值Morphometric valueHB-1種群HB-1 populationRoman &Hirschmann(1969)JZ-257種群JZ-257populationLoof(1960)體長/體前端至食道與腸連接處Body length/Length from the lips to thejunction of esophageal gland and intestine5.3±0.5(4.5～6.2)6.3±0.3(5.7～7.0)5.6±0.7(4.3～6.7)6.0(5.7～6.1)體長/體前端至食道腺末端的距離Body length/Length from the lips toesophageal gland end4.0±0.2(3.4～4.5)4.2±0.4(3.5～5.0)體長/尾長Body length/Tail18.9±1.6(16.7～22.2)18.4±0.8(16.9～20.6)18.4±1.5(16.0～21.3)20.5(17.7～22.9)尾長/肛門處體寬Tail length/Tail diameter at anus2.3±0.4(1.1～2.7)2.1±0.2(1.9～2.7)體前端至陰門的距離×100/體長Distance of vulva from the lips×100/Body length79.3±1.4(79.3～83.6)77.4±1.2(75.0～82.0)81.0±1.6(79.0～83.5)83.0(82.0～84.0)尾長/μmTail length23.1±1.7(24.3～26.7)27.3±1.6(24.0～30.6)23.7±2.7(20.5～28.0)陰門與肛門的距離/μmDistance from vulva to anus66.8±8.9(59.8～91.9)84.2±7.6(57.6～100.4)59.5±8.6(45.0～74.0)口針長/μmStylet length15.0±0.8(14.1～17.1)15.0±0.4(14.4～16.8)15.2±1.0(14.2～17.0)16.0～17.0桿部長/μmMetenchium length7.2±0.6(7.0～8.5)7.6±0.6(6.9～9.0)背食道腺開口到口針基部球的距離/μmDistance between dorsal esophageal gland opening and stylet knobs2.5±0.4(1.9～3.1)2.2±0.3(1.8～2.6)2.3±0.5(1.8～3.3)排泄孔至體前端距離/μmLength from anterior end to excretory pore75.2±2.5(74.0～82.0)80.9±3.1(74.0～86.0)75.7±4.3(71.3～80.3)體前端至食道腺末端距離/μmPharynx length108.2±6.4(101.8～114.6)103.9±4.4(96.9～110.5)食道腺覆蓋長度/μmPharyngeal overlap26.0±5.3(19.0～38.9)26.1±3.9(21.4～34.1)后陰子宮囊長度/μmPost-vulval sac length22.4±2.0(18.6～26.9)18.1±2.2(15.8～22.2)側區寬/μmLateral field width5.9±0.7(6.1～7.3)5.6±0.8(4.9～6.1)尾環數/個No. of tail annuli20.0±1.4(17.0～23.0)20.0±1.1(18.6～21.4)

注：數據均為測量值的平均值±標準差(最小值～最大值)。HB-1和JZ-257測量樣本數量分別為16和13個。
Note: Values represent the mean of measurement±standard deviation (minimum value～maximum value). The number of HB-1 and JZ-257 specimens was 16 and 13, respectively.

2

.

1

.

1

HB-1種群的形態特征

1)雌蟲特征(圖1)：雌蟲短粗呈圓筒狀，經高溫熱殺死后蟲體僵直且略向腹面彎曲(圖1(a)和(i))。頭架骨化明顯；唇區低平稍溢縮(圖1(b))，兩唇環寬度近乎相等；口針強壯，長14.1～17.1 μm，口針基部球圓，前緣凹陷(圖1(f)～(h))；背食道腺開口距口針基部球1.9～3.1 μm；中食道球卵圓形，寬約占該處體寬的2/3；排泄孔位于中食道球與食道腺末端近居中部位，與陰門同側；食道腺覆蓋腸側腹面(圖1(c))；側區有4條側線(圖1(e))；陰門橫裂，與肛門的距離約為尾長的3倍；后陰子宮囊長，未見其分化(圖1(d))；尾部末端寬圓，尾環明顯(圖1(j)～(m))。

2)雄蟲未見。

2

.

1

.

2

JZ-257種群的形態特征

1)雌蟲特征(圖2)：蟲體粗壯較短，熱殺死后略向腹彎(圖2(a)和(m))。唇區較低，明顯溢縮(圖2(b))；頭架骨化不明顯；口針發達，中等長度，約14.2～17.0 μm；口針基部球寬，表面略凹(圖2(c)和(d))；背食道腺開口距口針基部大約1.8～3.3 μm；中食道球發達呈橢圓形，直徑占該處體寬的一半；食道腺覆蓋腸前端較長；排泄孔位于食道腺與腸連接處的前端(圖2(g))；側區有4條側線(圖2(h))；卵母細胞單行排列(圖2(i))；后陰子宮囊短且長度不等，無明顯分化(圖2(e))；尾部光滑無紋，形態多變化，通常寬圓，偶呈平截狀或指狀，略向腹面彎曲(圖2(j)～(l))；尾環18～22個。

2)雄蟲未見。

2.2 分子生物學鑒定結果及系統進化分析

2

.

2

.

1

分子生物學鑒定結果

1)rDNA 28S D2-D3區序列分析。

使用線蟲28S通用引物對供試HB-1和JZ-257種群的rDNA 28S D2-D3區序列進行擴增，經測序后獲得2條長度分別為785和781 bp的序列(圖3)。將這2個序列在NCBI上進行BLAST比對，發現HB-1種群的rDNA 28S D2-D3區序列(MW487237)與斯克里布納短體線蟲多個種群(MT586733、JX047002和MG906747)的序列相似性較高，均為99.87%；JZ-257種群的rDNA 28S D2-D3區序列(MW487243)與落選短體線蟲種群(MT584828)的序列相似性為100%。

M:DL 2 000 marker;1:rDNA 28S D2-D3區;2:rDNA-ITS區。M: DL 2 000 marker; 1: rDNA 28S D2-D3 region; 2: rDNA-ITS region.圖3 HB-1(a)和JZ-257(b)種群的PCR擴增Fig.3 PCR results of HB-1 (a) and JZ-257 (b) populations

2)rDNA-ITS區序列分析。

使用線蟲ITS通用引物對供試HB-1和JZ-257種群的rDNA-ITS區序列進行擴增，經測序拼接后得到2條長度分別為1 107 bp和906 bp的序列(圖3)。將序列在NCBI上進行BLAST比對發現，HB-1種群的rDNA-ITS區序列(MW487240)與斯克里布納短體線蟲種群(MH729053和MT586755)的序列相似性最高，分別為98.74%和98.47%；JZ-257種群的rDNA-ITS區序列(MW487247)與落選短體線蟲種群(FR692298和FR692293)的序列相似性最高，分別為96.25%和96.04%。

2

.

2

.

2

種群系統進化分析基于HB-1和JZ-257種群的rDNA 28S D2-D3區和rDNA-ITS區序列，以細尖潛根線蟲(

Hirschmanniella

mucronata

)為外群，構建了多種根腐線蟲的系統進化樹。進化樹結果表明：HB-1線蟲種群和JZ-257線蟲種群分別與

P.

scribneri

和

P.

neglectus

聚在同一支(圖4和圖5)。

本研究獲得序列加“▲”標記，超過50%的后驗概率顯示在相應的分支上。下同。Newly acquired sequence with “▲” marker, with a posterior probability of more than 50% displayed on the corresponding branch.The same below.圖4 基于rDNA 28S D2-D3區序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on sequence of D2-D3 region of rDNA 28S

圖5 基于rDNA-ITS區序列構建的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS sequence

3 討論與結論

本研究對豫北地區鶴壁和焦作2市玉米根際分離到的2個根腐線蟲種群進行了形態和分子鑒定。通過形態測量值比較，發現這2個種群的主要形態特征均與之前的研究報道結果基本一致，僅個別數據存在差異。其中HB-1種群的測量值與Roman等對斯克里布納短體線蟲的描述相比，體長、肛陰門距離及排泄孔至體前端距離較短；JZ-257種群的測量值與Loof對落選短體線蟲的描述基本一致。結合分子生物學分析，rDNA 28S D2-D3區序列構建的進化樹顯示：鶴壁HB-1種群與其它斯克里布納短體線蟲種群聚在1個分支，焦作JZ-257種群與落選短體線蟲各種群群體成員聚在1個分支，置信度達到100%；rDNA-ITS區序列構建的進化樹顯示:鶴壁HB-1種群與河南許昌的斯克里布納短體線蟲種群(MH729053)聚類在1個單獨的小支上，兩者的親緣關系相比國內的其它3個種群更近，焦作JZ-257種群與不同地區落選短體線蟲4個種群間序列相似度相對較低，可能是由于短體線蟲不同地理種群之間的差異或種內變異所致。

土壤樣品中植物寄生線蟲的數量龐大，很難明確每1條短體線蟲的種類，而且短體屬線蟲外表形態特征大多非常相似，從土壤中分離到的每條短體線蟲只能通過肉眼識別挑取，然后進行后續的鑒定工作，將土壤中分離到的所有短體線蟲全部進行鑒定的操作性不強且工作量巨大。本研究從2市分離的樣本中分別隨機挑取了8條根腐線蟲雌蟲進行單雌純化培養，最終得到4個純化的鶴壁種群和5個純化的焦作種群，同一地市純化種群的分子鑒定結果一致，即鶴壁HB-1種群均為斯克里布納短體線蟲，焦作JZ-257種群均為落選短體線蟲。夏艷輝等在豫東地區商丘市的玉米根際發現咖啡短體線蟲和斯克里布納短體線蟲2種根腐線蟲復合侵染的現象，而本研究并未發現多種根腐線蟲復合侵染的現象。

植物寄生線蟲種類多樣且分布廣泛，是危害農作物的重要病原物之一。據統計，全世界約有50多萬種線蟲類群，植物寄生線蟲占其中的1/10左右。國內外報道較多的有根結線蟲(

Meloidogyne

)、孢囊線蟲(

Heterodera

)、矮化線蟲(

Tylenchorhynchus

)、松材線蟲(

Bursaphelenchus

xylophilus

)、螺旋線蟲(

Helicotylenchus

)、滑刃線蟲(

Aphelenchoides

)和根腐線蟲等。根腐線蟲的危害程度僅次于根結線蟲和孢囊線蟲，是1種專性內寄生線蟲，該屬線蟲寄主廣泛，國內外均有根腐線蟲寄生危害玉米的研究報道。巴西的玉米短體線蟲和短尾短體線蟲(

P.

brachyurus

)對玉米上的危害十分普遍；在加拿大的愛德華王子島省發現有刻痕短體線蟲(

P.

crenatus

)和穿刺短體線蟲在玉米上寄生危害，這2種短體線蟲對后期輪作作物的生長發育有顯著影響；美國的愛荷華洲玉米種植區有斯克里布納短體線蟲和落選短體線蟲侵染危害的報道；此外，一些歐洲國家也有多種根腐線蟲侵染危害玉米的研究報道。我國江蘇、遼寧、山東、內蒙古、河南和河北等多個省區均有根腐線蟲寄生危害玉米的研究報道。本研究對豫北地區鶴壁和焦作2市玉米田中分離到的2個根腐線蟲種群進行了種類鑒定，通過形態特征和分子數據明確了供試HB-1和JZ-257種群分別為斯克里布納短體線蟲和落選短體線蟲。該研究結果為豫北地區根腐線蟲的發生分布、根腐線蟲的識別與防控提供了一定的科學依據。