基于微生物16SrRNA測序技術對ICR小鼠傳代后腸道菌群變化的分析

張璐瑤 孟 琳 顓清芮 傅祥偉，3 侯云鵬*

(1.中國農業大學 生物學院/農業生物技術國家重點實驗室,北京 100193；2.中國農業大學 動物科技學院/畜禽育種國家工程實驗室,北京 100193；3.新疆農墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室,新疆 石河子 832000)

哺乳動物胃腸道內定植了1 014種細菌，這些細菌基因總和是宿主基因數目的 100 多倍，因此也被稱為寄主體內的“隱形器官”。近年來關于哺乳動物腸道微生物的研究表明，腸道微生物可以通過調節內分泌和神經等方式參與機體的能量代謝、物質吸收、免疫調節等多項生命活動。作為宿主體內控制代謝的隱形器官,腸道微生物失調可能造成多種代謝紊亂疾病，如肥胖，Ⅱ型糖尿病，脂肪肝和動脈粥樣硬化等。此外，腸道菌群易受宿主年齡、性別以及飲食等應激性環境因素的影響。

小鼠腸道中存在大量的微生物菌群,這些微生物菌群結構復雜種類繁多,參與宿主的代謝,在宿主的消化吸收和免疫調控方面均發揮了重要作用,對小鼠的生長發育有很大影響。ICR品系小鼠以多產為目標進行選育，由美國癌癥研究所(Institute of cancer research)分送各國飼養的實驗小鼠ICR。ICR品系小鼠毛色白化，同時具有適應性強，體格健壯，繁殖力強，生長速度快，實驗重復性好等特點，是常見的實驗室模式動物。結合本實驗室和我國的從事實驗動物飼養管理的研究者發現，經過長時間和多代次的近親擴繁，ICR品系小鼠隨著繁殖代次的增加會出現一些生長和繁殖性能異常的狀況。經統計分析后發現，ICR品系小鼠傳代后新生子代的生長速度顯著降低，各年齡段體重顯著降低，體長顯著降低等現象。

隨著基因組技術和二代測序技術的發展,研究微生物群落結構也實現了從傳統的細菌培養基提取法到使用高通量測序技術的轉變。其中，16SrRNA測序已經成為研究微生物群落組成及其分布的重要手段。16SrRNA測序技術是通過比對細菌 16SrRNA 序列對細菌進行快速種屬鑒定的一種方法。與此同時16SrRNA測序技術還可以對樣品中的優勢物種以及一些未知的物種進行檢測和分類，獲得樣品中的微生物組成并計算出它們的相對豐度。此外，16SrRNA測序還可以通過差異菌群進行差異代謝通路預測分析，預測腸道微生物的變化帶來的代謝差異表型等。由此，猜測ICR品系雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現的生長異常可能與其腸道微生物的改變有關。為探究ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現的生長異常和其腸道微生物的關系，分別收集F0、F1、F2和F3代18周雄鼠的大腸內容物，每組收集6個重復，通過16SrRNA測序技術，研究ICR雄性小鼠傳代之后腸道菌群的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

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試驗動物

清潔級雌性ICR小鼠20只，雄性ICR小鼠10只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)7周齡，體重25～30 g。實驗動物飼養于中國農業大學西校區動物實驗室，小鼠繁殖飼料喂養，自由進食、飲水。小鼠繁殖飼料具體營養成分見(表1)，從華阜康實驗動物公司購買。動物實驗室嚴格按照相關參數進行控制：小鼠自由采食和飲水，供應充足，墊料每周更換一次。光照控制在12 h∶12 h(北京時間8:00～20:00光照)，溫度控制在20～25 ℃，濕度為45%～55%。

表1 飼料配方Table 1 Feed formula

1.2 試驗方法

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動物建模方式

所有小鼠均在清潔級鼠房飼養一周以適應環境，將這些小鼠作為F0代記錄。隨后，標記耳號(耳號按繁殖代次標記為：F0:10XX)并記錄后，每籠按照雌雄比2∶1進行合籠。雌鼠明顯懷孕后，取出單籠飼養。產仔記為F1代，及時記錄產仔數與出生體重(注意初產雌鼠易食仔，需及時查看處理；若雌鼠流產導致妊娠失敗也需記錄)。幼鼠F1代21日齡時斷奶，標記耳號并記錄性別與離乳體重，將飼料剝碎放入幼鼠籠內便其采食。35日齡(性成熟)時，取體況良好的F1代雄鼠與雌鼠1∶2交配進行下一代繁殖實驗，此時應注意避免近親交配，產仔標記為F2代。處理過程與上述F0代時處理相同。以此類推，F2代雄鼠和雌鼠1∶2交配后產生的后代記為F3代，以此類推，將其后代分別標記為F1：11XX，F2：12XX，F3：13XX，F4：14XX， F5：15XX。

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腸道微生物樣本收集

小鼠處死后，取大腸中的內容物于無菌凍存管中，分別收集F0、F1、F2和 F3 代 18周 雄鼠的大腸內容物，每組收集6個重復。標記好后立即投入液氮中迅速冷凍。待所有樣本收集完成后，轉移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。

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腸道微生物樣本DNA提取

大腸內容物標本解凍以后，按照Fast DNA SPIN Soil Kit (MP Biomedicals，Santa Ana，CA)說明書的操作說明進行樣本DNA提取，提取細菌DNA。所有樣品全部提取完成后，放入干冰中送檢，使用Qiime平臺進行16SrRNA測序。后續的細菌DNA擴增和數據分析均由北京奧維森科技有限公司承擔。

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細菌DNA擴增

對腸道微生物樣本的16SrRNA V3～V4可變區進行PCR擴增，引物為(F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT 北京奧維森科技有限公司)。選擇Premix Taq 試劑。PCR擴增反應體系如下：94 ℃預變性5 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 28個循環； 72 ℃延伸7 min。然后使用1%瓊脂糖凝膠電泳對樣本質量進行定量檢測，最終選擇DNA濃度>50 mg/L、總量>3 ng的24份樣品進行16SrRNA測序。

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細菌16SrRNA測序分析

使用16SrRNA的高可變區QIIME測序技術，對樣品的16SrRNA V3區PCR產物進行測序，結果以“Fast-q”格式存儲。同時，使用Mi-seq測序得到Pair-End(PE)雙端序列數據，對測得的數據進行質控分析，經過一系列的篩選，拼接和去冗余處理等，最終得到優質的數據。質控分析過程中，需要使用Trimmomatic (V0.36),Pear (V0.96)，Flash (V1.20)，Vsearch (V2.7.1)等相關軟件。

將序列按照相對豐度排序，排列順序從高到低。所有序列依據不同的相似度進行OTU劃分，對大于97%相似水平的OTU進行生物信息分析。結合QIIME(version 1.9.1)平臺，參考16S細菌和古菌核糖體數據庫, kSilva2(Release128/132 http:∥www.arbsilva.de)，RDP(V16 http:∥rdp.cme.msu.edu/),Greengene(Release13.5 http:∥greengenes.secondgenome.com/)采用RDP classifier貝葉斯算法進行分類學分析。最后通過序列比對獲得每個OTUs的物種分類信息。使用PICRUSt對OTUs豐度標準化，并將每個標準化的OTUs對應到相應的基因進化樹，從而得到相應的KEGG信息，并用STAM P對得到的KEGG進行差異分析。

1

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統計分析使用SPSS分析軟件中的獨立樣本

t

檢驗對小鼠的體重，微生物多樣性以及特定菌種差異分析。

P

<0.05為顯著性差異，

P

<0.01為極顯著性差異，

P

>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同繁殖代次ICR雄性小鼠在相同周齡的體重分析

為了探究不同代次ICR品系小鼠的生長發育情況，在0、3、5和18周4個時期分別取F1、F2、F3、F4和F5 代雄性小鼠進行稱重，每組樣本數不低于20只。統計結果如圖1所示，在0、3、5和18周，小鼠的體重隨著代次的積累均呈下降趨勢，且差異顯著，說明ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加，體重顯著降低。

*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001,ns差異不顯著(P>0.05)。下同。* Represents P<0.05, ** Represents P<0.01, *** Represents P<0.001, ns represents significant difference at 0.05 level。The same below.圖1 不同代次ICR雄性小鼠在相同周齡的體重比較Fig.1 Comparison of body weight of ICR male mice of different generations at the same age

2.2 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物測序分析

為探究ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現的生長發育異常和其腸道菌群關系，分別收集F0、F1、F2和 F3 代 18周雄鼠的大腸內容物，每組收集6個重復，對16S的V3～V4可變區進行16SrRNA測序。根據16SrRNA的測序結果，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，參考16 s細菌和古菌核糖體數據庫Silva，共產生 1 786 個 OTU,經過抽平處理剩余1 729個。如圖2(a)示，F0代有OTUs 有1 276個，其中特殊OTUs 有87個；F1代有OTUs 有1 258個，其中特殊OTUs 有113個；F2代有OTUs 有1 173個，其中特殊OTUs 有47個；F3代有OTUs 有1 195個，其中特殊OTUs 有47個。為了更好的顯示多個樣本之間的距離關系，將加權與未加權的unifrac樣本距離矩陣用熱力圖表現出來，如圖2(b)所示，聚類結果表明F0、F1、F2和 F3 代各組間微生物群落物種有明顯差異。

圖2 不同代次ICR雄性小鼠腸道微生物測序分析Fig.2 Intestinal microbial sequencing analysis of different generations of male ICR mice

2.3 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性指數分析

通過對每個樣品OTU總數和每個OTU的相對豐度進行樣品多樣性指數的計算。不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性比較結果見圖3。在分析Alpha 多樣性的過程中，通常使用Shannon-Wiener指數來反映樣本中微生物多樣性，Shannon指數利用各樣本在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。如圖3(b)所示，隨樣本序列數的增加，曲線逐漸趨于平坦，說明測序數據量足夠反映樣本中絕大多數微生物的信息，測序分析預測結果可信度較高。Chao1和Observed-species指數根據所測得OTUs的數量來預測樣品中微生物種類，兩者值越大，物種越豐富；由圖3(c)可知，F0、F1、F2和F3的chao1指數分別為922.035±78.932 8、821.1 625±72.941 8、757.502 5±19.1 453和613.325±106.878 7，各組兩兩比較均有顯著差異(

P

<0.05),隨繁殖代次的增加，chao1指數顯著下降。由圖3(d)可知，F0、F1、F2和F3的Observed-species指數分別為654.2±53.52 23、557.675±49.626 3、548.7±18.476 7和384.2±54.112 9，F0、F1和F2間兩兩比較無顯著差異(

P

>0.05),但F3代較前三組有顯著下降(

P

<0.001)。辛普森指數 (Simpson) 和香儂指數(Shannon)的計算是基于樣品的所有OTU豐度和均勻度及其注釋物種信息進行的。辛普森指數和香儂指數可以反映樣本的菌群種類數和每個菌種占總體群落的比例， Simpson指數越接近于1，香儂指數(Shannon)指數越大，說明樣品中的菌群種類越豐富，多樣性水平越高。由圖3(e)可知，F0、F1、F2和F3的香儂指數(Shannon)分別為5.3 275±0.607 0、5.7 375±0.481 5、4.425±0.484 1和3.5 775±0.417 7，F0和F1比較無顯著差異(

P

>0.05),但隨代次的增加，F2和F3的香儂指數(Shannon)指數顯著下降(

P

>0.05)。由圖3(f)可知，F0、F1、F2和F3的Simpson指數分別為0.865±0.075 50、0.902 5±0.069 56、0.877 5±0.044 25和0.815±0.03 697，各組兩兩比較均無顯著差異(

P

>0.05)。綜上，結果表明隨繁殖代次的增加，腸道菌群Alpha多樣性呈顯著下降趨勢。

圖3 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性比較Fig.3 Comparison of Alpha diversity of intestinal microbial in different generations of male ICR mice

2.4 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中門水平微生物類群的差異

不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群門水平聚類結果表明各組間微生物群落物種有明顯差異。如圖4(a)，在門水平上，各組的優勢菌群均為厚壁菌門(Firmicutes)(F0、F1、F2和F3組分別為83.3%，79.0%，81.8%和90.3%)和擬桿菌門(Bacteroides)(F0、F1、F2和F3組分別為6.0%、5.1%、4.0%和3.2%)。在F0組中擬桿菌門(Bacteroides)的豐度為6.0%，厚壁菌門的豐度為83.3%，且在F1組中擬桿菌門(Bacteroides)的豐度顯著低于F0組(

P

<0.01)，F2和F3組也顯著低于F0和F1組(

P

<0.01)(圖4(b))。此外，如圖4(c)，脫鐵桿菌門(Deferribacteres)在F2和F3組中的豐度也有顯著降低(

P

<0.01)。綜上，隨代次積累，ICR品系小鼠腸道微生物多樣性在門水平上有很大變化，并且隨代次積累，對一些特定的菌群，如厚壁菌門、擬桿菌門和脫鐵桿菌門豐度的影響更為深遠。

圖4 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中門水平微生物類群的差異Fig.4 Differences of phylum level microflora in the intestinal microbiota of different generations of male ICR mice

2.5 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中屬水平微生物類群的差異

如圖5(a)所示，毛螺菌科-NK4A136組，螺桿菌屬、乳酸球菌、梭菌屬-sencu-stricto-1、瘤胃球菌屬、彎曲桿菌屬、未確認的-毛螺菌科、鏈球菌屬、乳酸菌屬、球菌屬、埃希氏菌屬、普氏菌屬和擬桿菌-S24-7組等在各組腸道微生物群中屬水平微生物類群均有差異。在屬水平上，F0、F1和F2 3組的優勢菌群均為乳酸菌屬(

Lactobacillus

)(F0、F1和F2組分別為83.1%、62.8%和38.2%)，但F3代小鼠的一些未確認分類的菌屬占比較高，約為45.3%。此外，如圖5(b)所示，雖然F0、F1和F2三組中乳酸菌屬均為優勢菌群，但各組的乳酸菌屬豐度有顯著差異(

P

<0.05)，且隨代次的積累呈逐漸下降的趨勢。埃希氏菌屬(

Escherichia

)(F0、F1、F2和F3組分別為0.015%、0.032%、0.439%和2.41%)在F1、F2和F3代中的豐度有顯著升高(

P

<0.01)(圖5c)。綜上，隨代次積累，ICR品系小鼠腸道微生物多樣性在屬水平上有很大變化，并且隨代次積累，產生的影響更為深遠。

圖5 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中屬水平微生物類群的差異Fig.5 Differences of genus level microflora in the intestinal microbiota of different generations of male ICR mice

2.6 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的差異代謝途徑(KEGG)預測

為進一步探究ICR子代體重下降的機制，本研究針對這一變化出現的差異最明顯的兩個組，即F0代和F3代的腸道微生物進行KEGG差異代謝通路預測。如圖6可知，KEGG分析發現14條代謝途徑有顯著差異，其中，乙醛酸鹽代謝、胰島素信號通路、苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸生物合成途徑，萜類化合物生物合成途徑，肽聚糖生物合成和糖酵解糖異生作用在F3組中的豐度顯著低于F0組(

P

<0.05)，結果顯示F3代氨基酸合成，糖類代謝等多條基礎代謝通路受損。因此，不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的變化可能對小鼠的新陳代謝有一定影響。

圖6 F0和F3組腸道微生物差異生物功能代謝通路預測Fig.6 Analysis of metabolic pathway of biological different functions of the fecal microbiota in different generations of male ICR mice

3 討 論

3.1 ICR雄性小鼠傳代后腸道微生物多樣性顯著降低

本研究采用16SrRNA基因高通量測序技術分析ICR雄性小鼠隨著繁殖代次增加出現的生長異常和其腸道菌群的關系。通過對測序結果的深度挖掘和分析，發現隨代次積累，ICR雄性小鼠腸道微生物多樣性顯著降低，優勢菌門如擬桿菌門豐度顯著降低，相關益生菌門如脫鐵桿菌門的豐度也顯著降低，且隨代次的積累逐漸下降。以上結果顯示腸道菌群的失調可能是導致ICR雄性小鼠出現生長異常的原因。大多數細菌可被可歸為兩大類，一大類是厚壁菌門，包括葡萄球菌、鏈球菌等；另一大類是擬桿菌門。有研究表明腸道菌群多樣性會影響宿主的體重，在對各組腸道菌群的分析中，不難發現擬桿菌門豐度顯著降低，這些變化可能與ICR雄性小鼠體重降低有關。另外值得注意的是，在針對屬水平的腸道微生物豐度分析中，發現隨ICR雄性小鼠繁殖代次的積累，乳酸菌屬豐度顯著降低，且隨代次的積累呈逐漸下降的趨勢。

乳酸菌(

Lactic

acid

bacteria

，LAB)是一類在動物胃腸道中廣泛存在的厭氧或兼性厭氧性細菌，且此類細菌利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸等有機酸，是一類廣譜益生菌。作為益生菌，乳酸菌具有豐富的物種多樣性，包含18個屬，共200多種。乳酸菌在代謝過程中可以為宿主供給必需營養物質，增強代謝，促進其生長。乳酸菌還可以調節腸道環境酸堿平衡，使其符合淀粉酶和糖化酶等消化酶的最適pH，促進營養物質的消化吸收。此外，乳酸菌可以改善腸道微環境，抑制一些有害的致病菌的生長，增強生物體對疾病的抵抗力。基于此，本研究認為乳酸菌豐度的降低是造成 ICR雄性小鼠子代出現生長發育異常的一個重要原因。

3.2 ICR雄性小鼠KEGG差異功能預測

除了益生菌缺失對腸道菌群多樣性造成的影響之外，腸道菌群還在機體不同的代謝途徑中發揮作用。差異菌群導致的代謝異常可以進一步解釋ICR雄性小鼠子代出現生長發育異常表型。結合KEGG分析表明，隨繁殖代次增加，ICR雄性小鼠的苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸生物合成等氨基酸合成途徑，萜類化合物生物合成途徑，胰島素信號通路，糖酵解糖異生作用等糖類代謝途徑可能會出現表達異常的情況。芳香族氨基酸中的苯丙氨酸、色氨酸屬于必需氨基酸，而酪氨酸是半必需氨基酸。其中苯丙氨酸可以氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經遞質和激素，參與機體糖代謝和脂肪代謝，因此芳香族氨基酸代謝對機體的其他兩大代謝途徑有很重要的調節作用，芳香族氨基酸代謝失調將直接導致機體的代謝功能紊亂。此外，胰島素信號通路在機體代謝的調控方面也有舉足輕重的地位。胰島素是能量代謝的主要調控激素，胰島素與受體結合后，激活受體中的蛋白酪氨酸激酶(PI3K)，被激活的酪氨酸激酶作用于受體底物，使受體底物發生磷酸化，隨后激活3種已知的 AKT 異構體，最終通過多種不同的途徑參與到胰島素的代謝調節中，促進機體對能量利用。通過圖6可以推測ICR雄性小鼠能量利用率也在逐漸降低。

3.3 展望

本研究結果初步探明ICR雄性小鼠的腸道菌群失衡可能是導致其生長發育異常的機制之一。由于機體腸道微生物的組成結構復雜,本研究僅在門和屬水平對腸道菌群進行了研究，并根據KEGG分析了可能影響的基礎代謝通路，對于具體關鍵微生物和生長發育之間的因果關系值得進一步研究。在后續的研究中，可以考慮對ICR小鼠進行乳酸菌等益生菌的灌胃試驗，觀察是否可以改善ICR雄性小鼠后代發育異常和體重下降等異常情況。

本研究結果同時表明，F2代前優勢菌群未發生明顯改變，建議使用ICR子代進行試驗研究最好在F2代前，如確需更多子代進行研究，建議考慮以非近親繁殖方式的進行交配以進行擴繁和傳代。對個體一致性和遺傳表型穩定性一要求較高的生物學試驗ICR鼠不建議作為首選，如果實驗室經費和資源有限，在使用ICR小鼠進行繁殖實驗時，須定期引入親緣關系較遠的ICR小鼠進行擴繁和傳代。

4 結 論

ICR雄性小鼠傳代后腸道微生物多樣性顯著降低，擬桿菌門和脫鐵桿菌門豐度顯著降低，乳酸菌屬豐度顯著降低，埃希氏菌屬等致病菌豐度顯著提高。結合差異代謝通路預測分析，隨代次積累ICR雄性小鼠氨基酸合成，糖類代謝等多條基礎代謝通路可能受損，這些變化均可導致ICR雄性小鼠后代發育異常和體重下降等缺陷。