不同品系絨山羊皮膚毛囊生長發育周期中chi-miR-107-3p及其相關基因的表達分析

劉 斌 王立忠 吳鐵成，2 馬躍軍,3 趙若陽 高玉林 閆新剛 李玉榮*

(1．內蒙古自治區農牧業科學院，畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.肉羊遺傳資源評價與繁育技術內蒙古自治區工程實驗室，呼和浩特 010031；3．阿拉善白絨山羊種羊場，內蒙古 阿拉善 750336；4.鄂爾多斯市立新實業有限公司，內蒙古 鄂爾多斯 017000)

絨山羊是重要的絨用經濟動物，其絨毛生長具有較強的季節性，但不同品種之間有很大的差異，大多數絨山羊在非長絨期(5～7月)不長絨，次級毛囊生長發育分為休止期(3～4月)、興盛前期(5～7月)、興盛期(8～12月)和退行期(1～2月)等4個階段，而有少數絨山羊可以常年長絨(6月開始長絨)。內蒙古白絨山羊是經過長期選育而形成的絨肉兼用型地方良種，分為巴彥淖爾市的二狼山型、鄂爾多斯市的阿爾巴斯型和阿拉善盟的阿拉善型三個類群，具有季節性長絨，羊絨細，纖維長，光澤好，絨毛手感柔軟，綜合品質優良的特性。鄂爾多斯市伊金霍洛旗蘇布爾嘎培育的敏蓋絨山羊(未經品種命名)，全舍飼養殖，具有常年長絨、產絨量高等特點，成為當地牧民主要的養殖家畜。2016年“敏蓋”商標被認定為鄂爾多斯市知名商標，2019年被國家知識產權局認定為馳名商標，因此暫命名為“敏蓋絨山羊”。絨山羊絨毛生長受遺傳、營養和光照、溫度等環境因素的影響，但遺傳占主要影響因素，從基因調控的方向研究皮膚毛囊生長發育顯得尤為重要。miRNA是真核生物中存在的小分子非編碼RNA家族，具有抑制靶向mRNA轉錄、翻譯或者能夠剪切靶向mRNA并促進其降解的功能。

近年來，國內外許多學者研究報道miRNA在毛囊形態發生、毛囊干細胞的增殖、分化和凋亡的穩態平衡過程中發揮著重要作用。Yuan等發現陜北絨山羊、內蒙古絨山羊不同時期的皮膚毛囊miRNA表達存在特異性。Yuan等發現miR-22可以促進毛囊退化，維持毛囊處于靜止期。馬濤發現miRNA-203在絨山羊毛囊發育的生長期和休止期均有表達，且在休止期的表達量顯著高于生長期，其候選靶基因的表達則相反。吳志紅通過實時熒光定量PCR和Western blot研究表明在胎兒皮膚成纖維細胞和上皮細胞中，chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p 和 chi-miR-532-3p 在mRNA和蛋白水平上均可不同程度的調控WNT10A的表達。chi-miR-107-3p是一類小分子RNA，Wu等通過高通量測序技術在薩能奶山羊睪丸組織中發現。Li等研究發現應用納米載體(TLN)可使chi-miR-107-3p缺失，dicer表達上調，從而加速角質形成細胞的分化，從而促進皮膚傷口的愈合。盡管有眾多的miRNA參與絨山羊皮膚毛囊周期性生長過程，但鮮少有chi-miR-107-3p在不同品系間絨山羊毛囊生長發育的比較研究。本研究基于課題組前期對阿爾巴斯型絨山羊光控增絨處理組和對照組皮膚毛囊樣品進行全轉錄組測序的結果(相關數據尚未發表)，篩選到chi-miR-107-3p及其相關基因

ADCK5

、

DSBC1

、

ARSA

、

FMAP4

、

RHBDF2

和

ALDH3A2

，可能與絨山羊皮膚毛囊的周期性生長發育有關。因此，以絨毛生長周期差異顯著的阿拉善型白絨山羊和敏蓋絨山羊為研究對象，應用組織切片技術對不同品系絨山羊處于不同生長周期毛囊結構進行比較分析，并通過qPCR方法對chi-miR-107-3p和相關基因的表達規律進行探究，旨在為絨毛生長周期變化分子基礎提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取內蒙古阿拉善白絨山羊種羊場和鄂爾多斯敏蓋絨山羊羊場體重相近的2歲絨山羊母羊各3只，分別在1、4、7和9月采集體側部位直徑1 cm的皮膚2份，一份用4%多聚甲醛固定進行組織切片制作，另一份快速保存于液氮罐中，用于qRT-PCR檢測。采樣前在取樣區域周圍皮下注射2%利多卡因進行局部麻醉，采樣過程符合動物福利要求。

1.2 試劑及儀器設備

主要試劑：伊紅染液、蘇木素染液等購自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛、石蠟、TRIZOL、Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、AL 2000、瓊脂糖、RNase-Free dd HO、氯仿、75%冰乙醇、2×Phanta Max Master Mix、1×TAE緩沖液；PrimeScript(TM) RT Master Mix (Perfect Real Time)、TB Green(TM) Premix Ex Taq(TM) II (RNaseH Plus)、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis和TB Green qRT-PCR User Manual等反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒等購自TaKaRa。

主要儀器設備：LEICA RM2016切片機、梯度PCR儀(Eppendorf,德國)、熒光定量PCR儀(CFX 96 Bio-Rad,美國)、正倒置一體熒光顯微鏡。

1.3 試驗方法

1

.

3

.

1

皮膚組織HE染色

將皮膚樣品在4%多聚甲醛中固定24 h后取出，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成7 μm的薄片，用常規HE染色方法染色，中性樹脂封片，干燥后觀察。由于皮膚在脫水透明過程中會發生收縮現象，因此在研究皮膚毛囊形態時需對皮膚收縮率進行校正。

皮膚收縮率=脫水透明后皮膚面積/
活體樣皮膚面積×100%

表皮厚：真皮層到皮膚表面的垂直距離，μm；

真皮厚：皮下脂肪組織到表皮層的垂直距離，μm；

初、次級毛球寬：用顯微鏡微測尺選擇不同視野10個完整的初、次級毛囊，測量其毛球的寬度，μm；

初、次級毛囊深：初、次級毛囊到表皮層的垂直距離，μm；

初、次級毛囊密度：利用顯微鏡微測尺選擇視野內10個完整初、次級毛囊個數，再進行換算為個/mm。

1

.

3

.

2

實時熒光定量法1.3.2.1 引物設計 chi-miR-107-3p序列為AGCAGCAUUGUACAGGGCUAU，

U6

作為內參基因。使用軟件Primer 5.0設計

RHBDF2

、

ADCK5

、

ARSA

、

ALDH3A2

、

DSBC1

和

FMAP4

基因熒光定量引物，選取

GAPDH

為內參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd.)合成(表1)。

表1 引物信息
Table 1 Primer information

基因名稱Gene name登錄號Login number引物序列(5'→3')Primer sequence (5'→3')片段大小/bpProduct length退火溫度/℃Annealingtemperaturechi-miR-107-3pNC_030833.1AGCAGCATTGTACAGGGCTAT10656 ℃RHBDF2XM_018063741.1F: GTCCCAGAGCATCCGCAAGTR: TCCACGCCTCCCACAGAA13158 ℃ADCK5XM_018058741.1F: CGCTCCTCTTCCCTCCTTR: CCACCCATTCTGGCAACT14864 ℃ARSAXM_005701596.3F: AGAGCTTTCCAGGGCACTCAR: CATCGTCTCAGGTCCGTTGT15562 ℃ALDH3A2XM_018064739.1F: ATTTACTCCAGCCTGCCTACR: CAGCCAAGTGTCACCTCA12662 ℃DSBC1XM_005676701.3F: GCAGGCTCTGACCGAATCR: CTGGGCTGGTGACAAGGA8858 ℃FMAP4XM_018064747.1F: TCCACCTTTGACCGAGACCR: GTTGATGCCATTGGCGTAG14758 ℃U6NM_001161346.2F: GGAACGATACAGAGAAGATTAGCR: TGGAACGCTTCACGAATTTGCG6862 ℃GAPDHXM_005680968.3F: CCACGAGAAGTATAACAACACCR: GTCATAAGTCCCTCCACGAT12060 ℃

1.3.2.2 總RNA提取及cDNA合成 用液氮將皮膚樣品研磨后，使用TRIZOL提取總RNA，采用紫外分光光度計法檢測總RNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳和A/A檢測RNA質量，保存于-80 ℃冰箱中備用。采用PrimeScript(TM) RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA(mRNA)，采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and TB Green qRT-PCR User Manual試劑盒合成cDNA(miRNA)，保存于-20 ℃備用。

1.3.2.3 qRT-PCR檢測 利用SYBR Green實時熒光定量PCR方法，以

GAPDH

基因為內參，對mRNA進行熒光定量；以

U

6為內參，對chi-miR-107-3p進行熒光定量。反應體系為TB Green(TM) Premix Ex Taq(TM) II (RNaseH Plus) 10 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free ddHO 7 μL。反應程序為95 ℃預變性2 min，(95 ℃ 變性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸 20 s)40個循環后進入溶解曲線，55 ℃到95 ℃，每0.6 s上升0.5 ℃。

1.4 數據分析

用2值法對chi-miR-107-3p及mRNA的表達量進行計算。運用SPSS 20.0對所得數據進行相關性分析，使用雙變量Pearson進行檢測，實驗數據均以“平均值±標準差”表示，以

P

<0.05為差異顯著，

P

<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同品系絨山羊皮膚毛囊組織顯微結構分析

校準并測量皮膚收縮率發現，2個品系絨山羊皮膚收縮率均約為65%。皮膚毛囊組織顯微結構觀察分析發現2個品系毛囊群結構均以三元型為主(3個初級毛囊和若干個次級毛囊)，可見少量的二元型和四元型。在退行期，次級毛囊細胞核增大，開始死亡，同時有部分細胞開始向外擴散，呈現刷狀分布，細胞破碎，逐漸成為一點甚至消失，毛囊群之間的結締組織較薄，連接不緊密(圖1(a)和(b)，圖2(a)和(b))；在休止期，次級毛囊基本退化，極少看到具有紅色內跟鞘的毛囊，毛乳頭完全消失，次級毛囊密度達到最低，毛囊群結構之間的結締組織變薄，次級毛囊排布散亂，大小不一，多成散狀分布(圖1(c)和(d)，圖2(c)和(d))；興盛前期，級毛囊再次重建，初級毛囊周圍出現多個小毛囊，同時也有幾個小毛囊緊密相靠，這說明有新的毛囊產生。如圖1(e)、圖2(g)、圖2(e)和圖2(g)，具有常年長絨特點的敏蓋絨山羊次級毛囊重建均已基本完成，初、次級毛囊均呈橢圓形，排列緊密、整齊。而阿拉善型絨山羊次級毛囊正處于重建階段，次級毛囊分布雜亂，仍有部分新生毛囊出現；在興盛期，次級毛囊重建完成，此時次級毛囊密度最大，具有紅色內跟鞘的毛囊也最多，次級毛囊排布整齊，毛囊群之間的結締組織連接緊密，結構明顯。如圖1(f)、圖2(h)、圖2(f)和2(h)。結合表2可見，2個品系絨山羊初級毛囊密度在整個生長周期內幾乎沒有變化，而次級毛囊密度變化顯著。皮膚毛囊興盛前期，阿拉善型絨山羊次級毛囊密度極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)，次級毛囊深、初級毛球寬、次級毛球寬和S/P值(次級毛囊數/初級毛囊數)等性狀均顯著小于敏蓋絨山羊(光控增絨)(

P

<0.05)。在皮膚毛囊興盛期，阿拉善型絨山羊次級毛囊密度、次級毛囊深和次級毛球寬顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)。表明兩種品系的絨山羊初級、次級毛囊在形態特征上基本一致，但在同一時期的生長規律不同。

表2 不同品系內蒙古絨山羊皮膚毛囊組織結構統計分析
Table 2 Statistical analysis of transverse skin and hair follicle tissue structure of different strains of Inner Mongolia cashmere goats

性狀Character月份Month阿拉善型絨山羊Alashan cashmere goats敏蓋絨山羊Mingai cashmere goats1月26.29±0.18 a27.13±1.90 a表皮厚度/μmDepth of secondary follicle4月20.24±1.58 a21.31±0.64 a7月27.51±3.48 a34.19±3.72 a9月32.36±1.64 a34.16±1.43 a1月1 015.94±14.34 a1 100.04±9.56 a真皮厚度/μmThickness of dermis4月1 012.42±61.44 a976.52±37.76 a7月1 091.89±19.50 a1 126.77±37.63 a9月1 093.35±10.38 a1 192.60±10.75 a1月2 015.54±20.19 a2 041.60±42.67 a初級毛囊深度/μmDepth of primary follicle4月1 707.83±24.75 a1 733.48±25.48 a7月2 073.33±7.51 Bc2 281.1±49.29 ABb9月2 394.65±34.89 a2 488.45±65.85 a1月1 162.54±16.75 a1 151.79±5.64 a次級毛囊深度/μmDepth of secondary follicle4月1 008.70±20.52 a1 070.24±2 977 a7月1 155.50±31.09 b1 276.27±19.01 a9月1290.91±29.86 b1 456.91±76.32 a1月224.44±7.85 a252.48±8.38 a初級毛球直徑/μmDiameter of primary hair bulb4月157.77±6.40 a181.36±13.77 a7月239.30±19.64 b305.57±7.59 a9月317.54±8.07 a313.70±10.74 a1月96.14±1.40 a101.71±3.37 a次級毛球直徑/μmDiameter of secondary hair bulb4月84.53±2.93 a91.53±9.70 a7月84.30±0.91 b112.56±5.31 a9月101.92±3.30 b118.73±5.69 a1月2.91±0.79 a2.63±0.76 a初級毛囊密度/(個/mm2)Density of primary follicle4月2.45±0.61 a2.54±0.57 a7月2.99±0.71 a2.90±0.54 a9月2.99±0.75 a3.00±0.75 a1月26.27±2.13 a27.18±3.36 a次級毛囊密度/(個/mm2)Density of secondary follicle4月22.54±3.11 a23.09±3.59 a7月28.36±2.29 A35.63±2.98 B9月39.09±4.04 a43.91±3.86 b1月9.61±2.40 a10.83±2.14 a初級毛囊數/次級毛囊數S/P4月9.49±1.67 a9.37±1.95 a7月10.41±2.72 a12.54±1.67 b9月13.85±2.64 a15.20±2.30 a

注：同行數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(>0.05)。
Note: In the same line, values with different small letters superscripts mean significant difference (<0.05); Different capital letters superscripts mean extremely significant difference (<0.01); While the same letter superscripts mean no significant difference (>0.05).

(a)、(c)、(e)、(g)分別是阿拉善型絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；(b)、(d)、(f)、(h)分別是敏蓋絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；▲初級毛囊；★次級毛囊。比例尺為100 μm。(a), (c), (e) and (g) were transverse sections of the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen, resting stage， prosperous and regression stage respectively; (b), (d), (f) and (h) were transverse sections of the skin follicles of Mingai cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; ▲ Primary hair follicle; ★ Secondary hair follicle. Bar is 100 μm.圖1 不同品系絨山羊皮膚毛囊橫切切片Fig.1 Transverse skin sections of different strains on cashmere goats

(a)、(c)、(e)、(g) 分別是阿拉善型絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；(b)、(d)、(f)、(h) 分別是敏蓋絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；▲初級毛囊；★次級毛囊。比例尺為100 μm。(a), (c), (e) and (g) were localisation sections of the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; (b), (d), (f) and (h) were localisation sections of the skin follicles of Mingai cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; ▲ Primary hair follicle; ★ Secondary hair follicle. Bar is 100 μm.圖2 不同品系絨山羊皮膚毛囊縱切切片Fig.2 Localisation skin sections of different strains on cashmere goat

2.2 不同品系絨山羊皮膚組織chi-miR-107-3p相關基因在不同毛囊周期的表達分析

2

.

2

.

1

不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p的表達分析由圖3(a)可見，阿拉善型絨山羊皮膚毛囊興盛前期chi-miR-107-3p達量極顯著高于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。對同一品種不同時期chi-miR-107-3p的表達量進行分析，由圖3(b)可見，阿拉善型絨山羊皮膚組織中，chi-miR-107-3p表達量在興盛前期極顯著大于興盛期(

P

<0.01)，且顯著大于退行期和休止期(

P

<0.05)。敏蓋絨山羊皮膚組織中，chi-miR-107-3p的表達量在休止期最高，且顯著大于其他3個時期(

P

<0.05)。因此說明，不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p的表達規律不同。

ALS：阿拉善型絨山羊; MG：敏蓋絨山羊; January:絨山羊皮膚毛囊退行期; April:絨山羊皮膚毛囊休止期; July: 絨山羊皮膚毛囊興盛前期；September：絨山羊皮膚毛囊興盛期。圖3a為相同時期不同品系之間的比較，圖3b為相同品系不同時期的比較，組間比較肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同。ALS: Alxa cashmere goat; MG: Mingai cashmere goat; January: the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen; April: the skin follicles of Alxa cashmere goats in resting stage; July: the skin follicles of Alxa cashmere goats in prosperous; September: the skin follicles of Alxa cashmere goats in regression stage respectively. Different small letters superscripts mean significant difference (P<0.05); Different capital letters superscripts mean extremely significant difference (P<0.01); While the same letter superscripts mean no significant difference (P<0.05); The same as below.圖3 不同品系絨山羊皮膚毛囊不同生長時期chi-miR-107-3p相對表達量Fig.3 Relative expression of chi-miR-107-3p in skin and hair follicles of different strains Cashmere goats

2

.

2

.

2

不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p相關基因在不同毛囊周期的表達量分析對不同品系絨山羊皮膚毛囊不同發育時期皮膚組織中

ADCK

、

DSBC1

、

RHBDF2

、

ALDH3A2

、

ARSA

和

FMAP4

基因的表達量進行差異性分析(圖4)。結果顯示，在休止期(4月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

ADCK

5基因的表達量極顯著大于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。興盛前期(7月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。興盛期(9月)，阿拉善型絨山羊和敏蓋絨山羊皮膚組織中

ADCK5

、

DSBC1

、

RHBDF2

、

ALDH3A2

、

ARSA

和

FMAP4

基因的表達量差異不顯著(

P

>0.05)。退行期(1月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

DSBC1

基因的表達量極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。在整個皮膚毛囊的生長發育周期中，

RHBDF2

基因的表達量在興盛前期到興盛期的過程中逐漸升高，在興盛期達到最高，之后逐漸降低，到達退行期，其表達量最低；

ALDH3A2

基因的表達量在休止期最高，隨著皮膚毛囊的生長發育，其表達量逐漸降低，到達興盛期，其表達量最低，到休止期表達量逐漸升高。由此可見,不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p相關基因在同一毛囊發育階段表達量不一致。

圖4 不同品系絨山羊皮膚毛囊不同生長時期mRNA的相對表達量Fig.4 Relative expression of mRNA in skin and hair follicles of different breeds(strains) Cashmere goats

2

.

2

.

3

chi-miR-107-3p及其相關基因和皮膚及毛囊性狀間的相關性分析對chi-miR-107-3p以及6個基因和兩品系絨山羊皮膚毛囊性狀數據進行相關性分析(表3)，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因與皮膚毛囊初級毛囊密度和真皮厚顯著相關(

P

<0.05)，與次級毛囊密度、S/P、表皮厚、初次級毛囊深及初次級毛球寬均極顯著相關(

P

<0.01)；

ALDH3A2

基因與初級毛囊密度、真皮厚和次級毛球寬顯著相關(

P

<0.05)，與次級毛囊密度、S/P、表皮厚、初次級毛囊深及初級毛球寬均極顯著相關(

P

<0.01)；

DSBC1

基因僅與初級毛囊密度顯著相關(

P

<0.05)，其他基因與皮膚毛囊性狀均未表現相關性。表明差異表達的chi-miR-107-3p及其相關基因并不完全與皮膚毛囊性狀相關。

表3 chi-miR-107-3p和相關基因與絨毛性狀的關聯分析
Table 3 The association analysis of chi-miR-107-3p and mRNA with fleece traits

性狀Characterchi-miR-107-3pADCK5DSBC1RHBDF2ALDH3A2ARSAFMAP4初級毛囊密度Density of primary follicle0.0390.9550.0120.0380.0100.0870.606次級毛囊密度Density of secondary follicle0.0010.7480.0840.0010.0050.2140.848初級毛囊數/次級毛囊數S/P0.0010.6900.1640.0010.0060.2630.994真皮厚度Thickness of dermis0.0110.7350.5610.0110.0450.1290.891表皮厚度Thickness of epidermis0.0030.5110.1290.0030.0090.1490.930初級毛囊深度Depth of primary follicle0.0010.5880.2120.0010.0020.046*0.941次級毛囊深度Depth of secondary follicle0.0010.2560.1080.0010.0030.2260.756初級毛球直徑Diameter of primary hair bulb0.0010.2680.1900.0010.0040.1690.926次級毛球直徑Diameter of secondary hair bulb0.0010.2090.4550.0010.0100.1570.581

注：表中數據表示相關性值。
Note: The data in the table represent correlation values.

3 討 論

3.1 不同品系絨山羊皮膚組織不同毛囊發育時期的形態結構分析

產絨量是絨山羊最主要的經濟性狀，次級毛囊結構特點和興盛期的長短很大程度上影響產絨量絨毛品質，其中遺傳力較高的3個性狀分別是毛囊深度、毛囊密度以及S/P值，且均與產絨量相關。對絨山羊皮膚組織顯微結構進行分析，發現初級毛囊密度雖然伴隨著毛囊的退化、更新有一定幅度的變化，但是其毛囊密度在各生長階段基本不發生變化。李長青等在對內蒙古絨山羊與遼寧絨山羊皮膚毛囊生長規律的研究中也得到相同的結論。由表2可見，阿拉善型絨山羊皮膚毛囊S/P值在興盛前期顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，S/P值越大，說明皮膚毛囊的生長發育越完善。范一星在不同毛被類型內蒙古絨山羊皮膚毛囊周期性生長及相關分子機理研究中指出，活性S/P值較大時，表明次級毛囊生長發育更完善，與本研究結構相似。由于敏蓋絨山羊屬于常年長絨型絨山羊，次級毛囊生長發育較早，皮膚毛囊興盛前期大部分毛干已經長出體表，次級毛囊毛球結構完整，而阿拉善型絨山羊此時期次級毛囊正處于重建過程當中，大部分毛囊發育仍不完整。在皮膚毛囊興盛期，阿拉善型絨山羊次級毛囊密度顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，阿拉善型絨山羊次級毛囊深顯著小于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，且次級毛球寬顯著小于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，原因是阿拉善型絨山羊屬于季節性長絨絨山羊，次級毛囊進入興盛期較遲。趙艷麗等對遼寧絨山羊常年長絨型和季節性長絨型絨山羊皮膚毛囊組織結構研究指出，由興盛前期轉入興盛期的過程中，常年型次級毛囊深、次級毛球寬均顯著大于季節型，這與本研究一致。

3.2 不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p在不同毛囊發育時期的的表達分析

miRNA是最新發現在絨山羊皮膚毛囊生長發育過程中起調控作用的一類小分子非編碼RNA，何玉龍等對不同發育階段小尾寒羊皮膚毛囊特異性miRNA鑒定分析，為從miRNA層面進一步挖掘改良羊毛品質及產量相關功能基因方面提供數據支撐與研究思路。本研究發現，皮膚毛囊興盛前期，chi-miR-107-3p在阿拉善型絨山羊皮膚組織中的表達量極顯著高于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。同時結合皮膚組織顯微結構分析，阿拉善型絨山羊次級毛囊正處于重建階段，而敏蓋絨山羊次級毛囊已經重建完成。這說明在皮膚組織中高表達的chi-miR-107-3p抑制次級毛囊生長發育。在興盛期，chi-miR-107-3p在2個品系絨山羊皮膚組織中的表達量均較低，此時皮膚毛囊的生長發育最快。進入退行期，chi-miR-107-3p的表達量逐漸增大，此時次級毛囊正處于退化階段。同時，經過chi-miR-107-3p與皮膚毛囊性狀進行相關性分析發現，chi-miR-107-3p與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(

P

<0.05)。Li等研究發現，應用TLN可使chi-miR-107-3p缺失，dicer表達上調，可以加速皮膚傷口的愈合，說明chi-miR-107-3p的缺失可以加速角質形成細胞的分化，從而加速皮膚的生長。由此推測chi-miR-107-3p是絨山羊皮膚毛囊周期性生長發育的重要影響因子之一，可能參與次級毛囊重建。

3.3 不同品系絨山羊皮膚組織RHBDF2和ALDH3A2基因在不同毛囊發育時期的表達分析

李曉凱利用毛被類型的名義顯著性候選基因和不同毛被類型不同毛囊周期比較轉錄組數據,進行WGCNA數據的挖掘分析,發現

RHBDF2

基因可能與不同毛被類型存在潛在一定的相關性。本研究結果表明，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因的表達量在興盛期最高，生長發育至退行期，

RHBDF2

基因的表達量逐漸降低，在休止期和興盛前期的表達量最低。敏蓋絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因的表達量在興盛期最高，且在退行期和興盛前期的表達量大于休止期休止期。同時對

RHBDF2

基因與絨山羊皮膚毛囊性狀進行相關性分析發現，

RHBDF2

基因與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(

P

<0.05)。說明高表達的

RHBDF2

基因可以促進皮膚毛囊生長。Hosur等在小鼠皮膚損傷傷口愈合反應的研究中發現，

RHBDF

2基因通過表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)信號的轉導參與上皮再生，可以通過增強表皮生長因子受體來加速皮膚傷口愈合，這與本研究結果相同。推測

RHBDF2

基因是絨山羊皮膚毛囊周期性生長發育的重要影響因子；兩個品系絨山羊皮膚組織中

ALDH3A2

基因的表達量均是在休止期最高，且極顯著大于其他3個時期(

P

<0.01)，退行期和興盛前期極顯著大于興盛期(

P

<0.01)，興盛前期顯著大于退行期(

P

<0.05)。可以發現，

ALDH3A2

基因的表達量在皮膚毛囊休止期至興盛期的過程中逐漸降低，由退行期至休止期的過程中逐漸增高。通過相關性分析發現，

ALDH3A2

基因與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(

P

<0.05)。說明高表達的

ALDH3A2

可能抑制皮膚毛囊的生長發育，是調控皮膚毛囊生長發育的重要影響因子。研究發現，Sj?gren-Larsson綜合征(SLS)是一種遺傳性神經皮膚疾病，由脂肪醛脫氫酶(FALDH)基因誘導

ALDH3A2

突變引起，導致脂肪醛脫氫酶缺乏，脂肪醛和脂肪醇積聚，會增加角質細胞的生長并且延緩皮膚屏障的恢復，

ALDH3A2

在絨山羊羊絨發育過程中的作用有待進一步驗證。

3.4 chi-miR-107-3p和RHBDF2基因的表達差異相關性分析

通過對chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因表達量進行分析發現，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因在絨山羊皮膚毛囊不同發育周期的表達量呈相反趨勢。在次級毛囊重建初期，chi-miR-107-3p表達量較高，而

RHBDF2

基因的表達量極低，隨著次級毛囊重建逐步完成，chi-miR-107-3p表達量顯著降低，

RHBDF2

基因的表達量逐漸增高。直到進入退行期，chi-miR-107-3p的表達量逐漸增高，而

RHBDF2

基因的表達量逐漸降低，休止期，chi-miR-107-3p的表達量達到最大值，此時

RHBDF2

基因的表達量最小。同時，結合基因表達與皮膚毛囊性狀的相關性分析，發現chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因均與初級毛囊密度和真皮厚度顯著相關(

P

<0.05)，且與次級毛囊密度、表皮厚度、初級和次級毛囊深度和毛球直徑極顯著相關(

P

<0.01)。同時，利用miRbase預測了

RHBDF2

基因與chi-miR-107-3p可能具有靶向關系，推測chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因可能存在負調控關系，共同調控絨山羊皮膚毛囊的周期性生長發育，但這一關系仍需通過雙熒光素酶報告進一步驗證。

3.5 展望

本研究通過觀察發現不同品系的絨山羊皮膚毛囊組織顯微結構相近。結合chi-miR-107-3p及其相關基因的表達情況，皮膚毛囊從興盛前期到興盛期、退行期到休止期，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因表達量變化總相反。說明chi-miR-107-3p可能通過負向調控

RHBDF2

基因的表達來抑制絨山羊皮膚毛囊的生長發育，但這一關系需進一步證實；根據

ALDH3A2

基因在絨山羊皮膚組織中的表達情況與毛囊形態密切相關發現，

ALDH3A2

基因可能是絨山羊皮膚毛囊周期性生長發育的重要影響因子。接下來的研究需進一步確定chi-miR-107-3p與其相關基因的靶向關系，及其對絨山羊毛囊生長發育的調控作用，對深入了解絨山羊皮膚毛囊周期性生長發育機制具有重要的意義。