犬用生物藥劑學分類系統的初步建立

王存才 李 康 郝智慧*

(1.中國農業大學 動物醫學院/中獸醫藥研究中心，北京 100193；2.青島農業大學 農用生物制藥實驗室，山東 青島 266109)

生物藥劑學分類系統(Biopharmaceutics classification system, BCS)是促進藥品開發和監管的重要工具，通過了解化合物在生物相關介質中的溶解度及其透過生物膜的滲透性，可以確定影響藥物吸收速率和程度的限制因素。并根據藥物的溶解度和滲透性將其分為以下四類:第一類:高溶解度，高滲透性(吸收良好的化合物)；第二類：低溶解度，高滲透性(表現為溶解率有限的吸收)；第三類：高溶解度，低滲透性(表現出滲透性限制的吸收)；第四類：低溶解度，低滲透性(口服生物利用度極差的化合物)。早在2000年時，美國食品和藥物管理局(FDA)就已將BCS納入到FDA的工業指南中，世界衛生組織(WHO)和歐洲藥品管理局(EMA)隨后也將BCS引入到了其藥品管理規范中用于指導藥物開發。此后，BCS成為了仿制藥在體內生物等效性研究的豁免依據，不僅加快了藥物篩選和新藥研發速率，而且顯著減少了研發成本。

隨著近年來獸醫藥的快速發展，BCS的概念也逐漸被引入到了獸藥領域。在2005年，Davis等率先探討了BCS應用于馬內服藥物的可能性。此后，Martinez等和Guo等分別研究了藥物在牛和豬體內的溶解度分類，并提出了相應的BCS溶解度標準。Liu等更是成功建立了適用于雞的BCS分類系統，為其他物種BCS的建立提供了參考。令人遺憾的是，由于犬與人在胃腸道生理解剖結構上存在的巨大差異，現有的BCS分類標準的適用性尚未外推到犬中，這限制了其在犬類藥物開發中的應用。

眾所周知，藥物溶解度是建立BCS的基本挑戰之一。其中犬用內服藥物的溶解主要取決于胃液體積，因為犬在給藥時通常沒有水共服。根據本實驗室前期對犬生理常數的研究，得到了24 mL空腹胃液容積，這為犬用藥物溶解度的研究提供了數據基礎。此外，溫度與pH也是影響藥物溶解的關鍵因素，特別是對于具有pH依賴性的藥物尤為重要。因此，如何獲得犬胃腸道生理參數并得到合適的溶解度條件是建立犬用BCS亟需解決的問題。

建立BCS的另一個挑戰是藥物在胃腸道中的滲透性。目前，藥物的吸收分數(Fa)是衡量內服藥物在腸道中滲透性的主要參數，根據質量平衡測定或與靜脈參考劑量比較，當被測藥物在胃腸道中的吸收分數Fa≥85%時被認為是高滲透性，反之為低滲透性。在臨床研究中，吸收分數可以通過平行人工膜滲透性試驗(PAMPA)、體外細胞培養、腸外翻法和原位腸灌注等方法進行研究，其中原位腸灌注法的結果最接近體內實驗，也是FDA指南推薦的方法，其可靠性已在大鼠和人等研究中被證實。然而，藥物在犬胃腸道中滲透性的研究目前還未見報道。

基于此，本研究擬通過測量犬的胃腸道生理常數和單通道腸灌注(Single-pass intestinal perfusion, SPIP)技術建立起用于測定犬用藥物溶解度條件和滲透性方法，并以此為依據初步建立犬用生物藥劑學分類系統(BCS)，為今后犬類內服藥物的開發提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

美托洛爾、阿莫西林、氨芐西林、多西環素、地高辛、林可霉素、鹽酸美洛沙星均由中國食品藥品檢定研究院提供；色譜級甲醇、色譜級乙腈購于美國Fisher公司；KOH、HCl、K-R溶液、生理鹽水均購于中國醫藥集團有限公司。

1.2 試驗儀器

十萬分之一分析天平(SA124S-CW)購于北京楚齊儀表有限責任公司；玻璃水銀溫度計購自江蘇宇威醫療器械有限公司；便攜式pH計購于上海雷克斯科學儀器有限公司；往復水浴恒溫振蕩器(SHZ-88A) 購于上海滬粵明科學儀器有限公司，蠕動泵(BT100-8)購于上海滬西公司；液相色譜儀(Agilent-1260)購于美國Agilent公司。

1.3 試驗動物

12只平均體重為10 kg健康的成年比格犬(6公6母)，均購于山東博龍實驗動物中心。本研究經青島農業大學動物實驗專業委員會批準[許可證號:SYXK(SD)20170005]，并按照青島農業大學實驗動物護理和使用指南進行飼養。試驗結束后，將這些動物實施安樂死，并被無害化處理。

1.4 方法

1

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4

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1

體溫測量

將玻璃水銀溫度計的前部均勻涂上凡士林以減少犬的不適，旋轉入直腸2～3 cm，直到獲得穩定的溫度讀數(約3～5 min)。犬體溫由兩名獨立的實驗人員進行測量和讀取，以便減少誤差。

1

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4

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2

胃腸液pH測定

通過外科手術的方法，分別刮取胃、十二指腸、空腸和回腸中的液體置于西林瓶中，將pH測量儀的探針快速插入到西林瓶中進行測量，待儀器讀數穩定后記錄數值。在兩次測量之間需要重新校準pH儀的準確性，并用蒸餾水徹底清洗電極。

1

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4

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3

標準曲線的建立

用十萬分之一天平精密稱取美托洛爾、阿莫西林、氨芐西林、多西環素、地高辛、林可霉素和鹽酸洛美沙星各50 mg到50 mL容量瓶中，用色譜級甲醇溶解并定容，配制成1 mg/mL的母液。用移液器分別從中吸取0.125、0.625、1.250、2.500、6.250和12.500 mL的母液到25 mL容量瓶中，再用色譜級甲醇定容至刻度，配制成濃度為5、25、50、100、250和500 μg/mL系列標準液。用0.22 μm有機濾頭過濾，取續濾液到進樣瓶中，然后經高效液相 (HPLC)檢測，色譜條件參考《中國獸藥典》2015版。

1

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4

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4

藥物計量數(

Do

)的計算將過量的阿莫西林、氨芐西林、多西環素、地高辛、林可霉素和鹽酸洛美沙星置于含50 mL不同pH(3.0、5.0、6.8、7.6和8.0)緩沖液的燒瓶中，在38.5 ℃恒溫水浴震蕩器中，以30 r/min的轉速震蕩24 h后再在38.5 ℃恒溫水浴震蕩器中靜置0.3 h。取上清液并適當稀釋，經0.22 μm濾膜過濾后，用HPLC測定藥物平衡溶解度，并根據平衡溶解度結果計算各藥物的計量數(

D

)。式(1)為劑量數(

D

)的計算公式：

(1)

式中：

M

為單次給藥的最大劑量，mg；

V

為犬胃液體積，mL；

C

為藥物平衡溶解度，mg/mL。當

D

≤1時為高溶解度，當

D

>1時為低溶解度。

1

.

4

.

5

在體原位腸灌注(Single

-

pass intestinal perfu

-

sion, SPIP)試驗前12 h禁食，并在前4 h禁水。前肢靜脈注射陸眠寧(0.2 mL/kg)將犬麻醉后，置于加熱裝置上保持38.5 ℃恒溫。經手術打開腹腔暴露小腸，結扎膽管以避免腸肝循環。分離出十二指腸、空腸和回腸，每段長約10 cm，并在被測各腸段的近端和遠端小心插入兩個自制EP套管。用生理鹽水輕輕沖洗腸道中內容物，直到液體變澄清為止。近端EP管連接到進口套管，遠端連接出口套管，在灌注液與進口管之間放置一個恒流泵控制流速。將空白灌注液在38.5 ℃恒溫下泵入腸道約15 min，以清除任何可能殘留的異物。然后改換為含藥溶液灌注30 min，以便達到腸道吸收穩態。后每隔15 min(15、30、45、60、75、90、105、120、135和150 min)更換一次標有重量的接收瓶。立即離心(10 000 r/min)取上清液，放入-20 ℃冷凍，直到HPLC分析。實驗結束時，用飽和氯化鉀處死試驗犬，剪取并準確測量灌注腸段的長度和直徑。實驗期間用紗布覆蓋手術區域并噴灑生理鹽水以保持濕潤。在SPIP研究中，以藥物在胃腸道中的吸收分數(Fa)來區分其滲透性的高低，當

F

≥85%時屬于高滲透性，

F

<85%為低滲透性。Fa的計算公式如式(2)所示：

F

=1-

e

-2

(2)

式中：

An

是吸收常數，代表口服藥物吸收的基本變量。其計算公式如式(3)所示：

(3)

式中：

R

為腸直徑，cm；

T

為藥物在腸內停留時間，min；Peff為藥物通過腸壁的有效滲透率，cm/s；滲透性系數結果表示為平均值±標準偏差，SD。

P

的計算公式如式(4)所示：

(4)

式中：

Q

為進口流量，mL/min；

C

′為穩態下的修正出口濃度，mg/mL；

C

為進入灌注液中的藥物濃度，mg/mL。

R

、

L

分別為腸段直徑與長度，cm。

C

′的計算公式如下，

(5)

式中：

C

為在規定時間間隔內測量灌注液中化合物濃度，mg/mL；?為在規定時間間隔內測量灌注液出口流量，mL/min。

1

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4

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6

灌注液的配制

灌注研究中使用的每種藥物的濃度是基于溶解在24 mL K-R緩沖液中的最高劑量，所有溶液均是現用現配。其中，美托洛爾分別配制成濃度為4、40和400 μg/mL的灌注液各2份，其中一份用鹽酸調節pH至6.8，另一份用KOH溶液調節pH至7.6，所有藥液均現用現配。

1.5 數據分析

所有動物試驗均為3次平行試驗，采用SPPS 24.0軟件進行獨立t檢驗和單因素方差分析，分別評估兩組和多次比較的差異，數據以平均SD表示。

2 結果與分析

2.1 藥物溶解度檢測條件的建立

圖1和表1分別列出了在禁食與進食兩種狀態下，比格犬體溫和胃腸道pH的變化情況。圖1顯示，在禁食與進食兩種狀態下比格犬的直腸溫度沒有顯著差異，平均溫度為(38.5±0.5) ℃。從表1中可以看出，胃腸道pH范圍為3.8～8.0，平均為6.6。其中胃液pH范圍在3.8～5.4，平均pH為4.6；十二指腸、空腸和回腸的pH范圍為6.1～8.0，平均pH為7.2。結合比格犬的空腹胃液體積24 mL，可建立一種犬用藥物溶解度體外檢測模型，即單次給藥的最大劑量能溶解在24 mL，pH 3.8～8.0的38.5 ℃水溶液中時被定義為高溶解度，反之為低溶解度。

表1 不同胃腸道部位的pH分析
Table 1 pH analysis in different gastrointestinal tract sites

狀態Condition胃Gastric十二指腸Duodenum空腸Jejunum回腸Ileum進食 Feeding3.8±0.76.4±1.17.8±1.07.5±0.6禁食 Fasting5.4±0.86.1±0.47.8±0.77.3±1.2

圖1 不同飼養條件下比格犬的核心體溫Fig.1 Core temperature of Beagles in different feeding conditions

2.2 模型藥物的標準曲線

采用HPLC測定模型藥物的峰面積，以藥物濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線。表2中是7種模型藥物的標準曲線，R表明藥物濃度與峰面積之間有良好的線性關系。

表2 模型藥物的標準曲線
Table 2 The standard curve of model drugs

藥物Drug標準曲線方程Standard curve equation相關系數R2Correlation coefficient阿莫西林 AmoxicillinY=257.73X+9.060.999 9氨芐西林 AmpicillinY=917.31X+5.390.999 9多西環素 DoxycyclineY=449.12X+2.710.999 9地高辛 DigoxinY=188.18X-0.640.999 9林可霉素 LincomycinY=380.59X+3.430.999 9鹽酸洛美沙星 Lomefloxacin hydrochlorideY=894.07X-81.490.999 6美托洛爾 MetoprololY=448.68X-0.120.999 8

2.3 藥物溶解度分類

模型藥物的平衡溶解度測定結果見表3，其中氨芐西林、鹽酸洛美沙星和美托洛爾受溶液pH影響較大，其他藥物沒有明顯的變化。根據藥物平衡溶解度結果，以最低平衡溶解度為條件對模型藥物的計量數

Do

進行了分類，結果見表4。其中阿莫西林、多西環素、地高辛被分為低溶解度，氨芐西林、林可霉素、鹽酸洛美沙星和美托洛爾被分為高溶解度。

表3 藥物在不同pH下的平衡溶解度
Table 3 Equilibrium solubility of drugs at different pH values

藥物DrugpH 3.0pH 5.0pH 6.8pH 7.6pH 8.0阿莫西林 Amoxicillin3.403.503.413.663.56氨芐西林 Ampicillin13.1812.6310.0011.5412.99多西環素 Doxycycline0.510.570.520.600.59地高辛 Digoxin///0.060.09林可霉素 Lincomycin38.2039.0138.0040.2040.23鹽酸洛美沙星 Lomefloxacin hydrochloride15.6415.7315.6020.3528.06美托洛爾 Metoprolol32.7528.8316.1118.7619.03

2.4 美托洛爾在犬腸道中的滲透性

在不同生理pH下，美托洛爾在小腸各區域段滲透性見圖2和表5。圖中顯示，美托洛爾(400 μg/mL)在小腸各段中的滲透性大小依次為：十二指腸>回腸>空腸，其中在十二指腸中的滲透性約是空腸中的1.4倍，表明該藥物的吸收依賴于腸道不同的部位。為了確定pH對美托洛爾滲透性的影響，在2個pH條件下(pH 6.8和7.6)分別測定了美托洛爾的Peff值。實驗表明，pH增加雖然會促進美托洛爾的吸收，但對在十二指腸、空腸和回腸中的通透性并沒有顯著影響(

P

=0.86)。表4顯示了在pH 6.8時，美托洛爾在小腸各區域段的吸收分數與Peff值一致，其Fa值均大于0.85，滲透性分類均屬于高滲透性。

表4 藥物溶解度分類
Table 4 Solubility classification of drugs

藥物Drug劑量/mgDoes溶解度/(mg/mL)Solubility計量數Does numberBCS分類BCS classification阿莫西林 Amoxicillin110 3.401.35低氨芐西林 Ampicillin11010 0.46高多西環素 Doxycycline100 0.518.17低地高辛 Digoxin10 0.066.94低林可霉素 Lincomycin22038.000.24高鹽酸洛美沙星 Lomefloxacin hydrochloride11015.600.29高美托洛爾 Metoprolol12516.110.32高

表5 美托洛爾在不同腸道部位的吸收分數
Table 5 Absorption fraction of metoprolol in different intestinal sites

腸道部位Intestinal site有效滲透率/(×10-4 cm/s)Effective permeability吸收分數/%Absorption fraction滲透性Permeability十二指腸 Duodenum1.45±0.1795高空腸 Jejunum1.05±0.1586高回腸 Ileum1.18±0.3290高

圖2 美托洛爾在不同腸段和不同pH下的有效滲透率Fig.2 Effective permeability values of metoprolol in different intestinal segments and pH

使用不同濃度 (4、40和400 μg/mL) 的美托洛爾在空腸進行原位灌注，其Peff值見圖3。圖中結果顯示，藥物在中低濃度灌注后的Peff值約是高濃度時的1.6和1.7倍，表明低中濃度的吸收效果較高濃度時更好。各組中美托洛爾的Peff值差異無統計學意義(

P

=0.31)。綜上研究表明，美托洛爾可以作為犬用藥物滲透性分類的邊界性藥物使用。

圖3 不同濃度下美托洛爾的滲透性Fig.3 Permeability of metoprolol at different concentrations

2.5 模型藥物的滲透性

使用SPIP方法檢測了7種犬用臨床常見藥物的腸道滲透性，以美托洛爾為邊界性藥物進行了滲透性高低的分類，結果見表5。其中多西環素、地高辛與美托洛爾被分類為高滲透性，而阿莫西林、氨芐西林、林可霉素與鹽酸洛美沙星被分類為低滲透性。

2.6 模型藥物的生物藥劑學分類

根據藥物溶解度與腸道滲透性研究，對7種模型藥物進行生物藥劑學 (BCS)分類，如圖4所示。在所有藥物中，美托洛爾被分為Class 1類，多西環素和地高辛被分為Class 2類，氨芐西林、林可霉素、鹽酸洛美沙星被分為Class 3類，阿莫西林被分為Class 4類。

圖4 模型藥物的生物藥劑學分類Fig.4 Biopharmaceutics classification of model drugs

3 討 論

測定藥物溶解度并建立適用的溶解度條件對于犬用藥物生物藥劑學分類系統(BCS)的開發是至關重要的，也是檢測藥物在腸道內滲透性高低的前提。目前藥物溶解度的測定條件是基于人胃腸道(GI)生理學而不是犬，因此，為獲取專屬溶解度檢測方法必須根據犬胃腸道生理參數對現有BCS溶解度標準進行調整。

溫度是影響溶解度的重要因素，藥物溶解度往往會隨著溫度的變化而改變。與人類(37 ℃)、豬(39 ℃)和雞(41 ℃)顯著不同，本研究結果顯示犬體溫是38.5 ℃。在此條件下測得的7種模型藥物的溶解度均高于獸藥典(25±2 ℃)中的數據記錄，這與Liu等在研究吡喹酮等雞用藥物溶解度時的發現是一致的。此外，由于犬胃液中的基礎pH變化很大，為確定影響藥物溶解度的pH范圍，也為排除因小腸pH遠高于胃而出現藥物在小腸析出等現象。本研究分別測定了犬進食前后胃腸道(GI)的pH變化，得到GI的pH范圍是3.8～8.0，這與Dressman等研究的犬因基礎胃酸分泌量較低而導致胃腸道pH偏高的現象相吻合，同時也填補了Papich等在研究犬用藥物溶解度時缺少胃腸道pH范圍的空白。此外，研究顯示犬胃液擁有比人更高的pH，這可能是導致多西環素、地高辛和鹽酸洛美沙星的溶解度變化更大的原因。考慮到影響藥物在犬體內溶解度的pH范圍，使用與人用藥物溶解度定義相同的犬用藥物的pH溶解度條件似乎是合適的。

表6 模型藥物的滲透性分析
Table 6 Permeability analysis of model drugs

藥物Drug有效滲透率/(×10-4 cm/s)Effective permeability標準差Standarddeviation (SD)滲透性分類Permeabilityclassification阿莫西林 Amoxicillin0.480.05低氨芐西林 Ampicillin0.620.21低多西環素 Doxycycline2.760.53高地高辛 Digoxin1.430.26高林可霉素 Lincomycin0.220.08低鹽酸洛美沙星 Lomefloxacin hydrochloride0.720.15低美托洛爾 Metoprolol1.050.33高

當試圖建立犬特異性BCS時面臨的另一個障礙是與腸道滲透性(Peff)分類相關的挑戰。盡管有如Caco-2細胞、平行人工膜通透性試驗(PAMPA)和基于磷脂囊泡的通透性試驗(PVPA)可用于預測Peff，但這些估算方法僅適用于人用藥物，因為沒有類似于人用BCS高滲透性或低滲透性分類的邊界性藥物(拉貝洛爾、美托洛爾、甘露醇等)的Peff來評估狗體內的有效滲透性。雖然利用藥物的logP或絕對生物利用度(F)有時可預測到藥物的滲透性大小，但這往往是那些已知的通過被動擴散以外的機制而被吸收的化合物(如通過轉運體或細胞旁路轉運)。基于此，本研究以美托洛爾作為犬用藥物滲透性分類的邊界性藥物。研究結果表明，美托洛爾在空腸和回腸中的吸收率相似，在十二指腸中的滲透率約為空腸的1.4倍，且pH和其自身濃度變化對吸收沒有顯著影響，這表明美托洛爾在犬胃腸道中的吸收過程與人體內相似。此外，美托洛爾在小腸不同部位的吸收分數(Fa)均大于85%，這表明美托洛爾暫時作為犬用藥物滲透性分類的標準藥物是合理的。需要進一步說明的是，使用絕對生物利用度(F)作為滲透性標準是不合適的，因為腸道壁和肝臟代謝的影響以及膜內流入和流出轉運蛋白活性可能會引入偏差。而吸收分數(Fa)作為滲透性標準已被廣泛承認，其正確性優于絕對生物利用度。為證明BCS滲透分類方法的適用性，本研究對7種犬臨床常用藥物為模型進行了檢測，并分別以美托洛爾的Peff值和

Do

作為滲透性和溶解度指標進行初步的BCS分類。結果顯示，7種藥物均被正確分類。盡管本研究使用的方法存在局限性，但評估結果強烈表明，美托洛爾暫時作為犬用藥物滲透性分類的邊界性藥物是合適的。

誠然，在初步建立的BCS分類系統的基礎上，為提高對犬用藥物分類的準確性，還有很多工作要做。應用BCS預測藥物吸收依賴于廣泛的變量，除配方因素和胃腸生理因素外，還需考慮腔內和粘膜酶反應、腸道運動、藥物首過作用和轉運蛋白活性等影響。此外，比格犬作為標準的中型犬被用于本試驗，根據其生理特性建立的BCS分類系統是否適用于小型犬和大型犬還有待于研究。正因為如此，在后續BCS分類系統的開發中，應建立對應的體外預測模型，并結合體內數據進行體內外相關性分析，建立相關數據庫。通過這些努力，將獲得更好的評價決定體內藥物吸收的關鍵因素，并確定潛在的錯誤來源，以支持BCS在藥物開發及臨床應用上的指導作用。

綜上所述，根據藥物溶解度條件和滲透性方法建立的犬用藥物BCS分類系統，不僅填補了該系統在犬用藥物領域的空白，也為其他物種BCS分類系統的開發和建立提供了參考。將BCS應用于獸藥研發，不僅可以預測和優化藥物的臨床性能，而且有助于避免額外的體內研究，顯著減少開發藥物產品的成本和時間。