雪糕中的菌落總數測量不確定度評定

劉 暢，趙新宇

（1.鞍山市檢驗檢測認證中心-食藥所，遼寧鞍山 114021；2.輝山乳業（沈陽）銷售有限公司研發部，遼寧沈陽 110121）

冷凍飲品是人們在夏日里消暑解渴的首選，然而冷凍飲品的生產工藝環節較多，且產品裸露在空氣中時間較長，生產過程中很容易受到微生物污染[1-2]。在食品安全評價中，菌落總數作為食品檢測中最常見的衛生指標，通常用于表明細菌污染的程度[3]。但由于微生物的特殊性，其在樣品中的分布并不均勻，所以檢測結果會存在較大的分散性。不確定度是指由于存在不可避免的誤差，對被測量值不能肯定的程度。不確定度越小，測量值與被測量的真實值越接近[4]。為了保證檢測的準確性，本文將依據菌落總數測定標準對市售某品牌的同一批次雪糕進行菌落總數的檢測，并采用bottom-up 方法與食品微生物測量不確定度評估指南對檢測結果進行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售某品牌雪糕；平板計數瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司；0.85%生理鹽水，北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

百級潔凈室；FZ-20001 電子天平，上海凡展衡器有限公司；YXQ-LS-100S Ⅱ蒸汽壓力滅菌器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；HH-4 恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；SPX-250F-Ⅱ生化培養箱，上海龍躍儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

用滅菌鑷子除去包裝紙，將冰棍/雪糕部分放入無菌均質袋中，木棒留在袋外，捏緊袋口，用力抽出木棒，置45 ℃水浴15 min，溶化后立即進行檢驗[5]。

1.3.2 檢測過程

以無菌吸管吸取25 mL 樣品置于225 mL 生理鹽水均質袋中，充分混勻，制成1 ∶10 的樣品勻液；用1 mL 無菌吸管吸取樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入9 mL 生理鹽水試管中，振搖試管混合均勻，制成1 ∶100 的樣品勻液，倍比稀釋；分別吸取1 mL 樣品勻液于兩個無菌平皿內，及時將約20 mL 冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻；待瓊脂凝固后，翻轉平板于（36±1）℃培養48 h。

1.3.3 菌落總數計數

如果只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再乘以相應的稀釋倍數，作為每mL 樣品中菌落總數結果；如果有兩個連續稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，按式（1）進行計算[6]。

式中：N為樣品中菌落數，CFU/mL；ΣC為平板菌落數之和，CFU/mL；n1為第一稀釋度平板個數；n2為第二稀釋度平板個數；d為稀釋因子。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源

本實驗以市售某品牌同一批次的10 個雪糕為樣品，固定設備，培養基、試劑同一批次，單人兩次開展檢測，每個樣品做3 個稀釋度，每個稀釋度做2個平行，最終得到20 個檢測結果。由于無菌室的潔凈度、培養基的質量、培養箱的溫度波動以及檢測人員的操作水平等分量的不確定度不能依靠直接測量或統計學的方式進行評定，因此本實驗僅考慮次級取樣、倍比稀釋、傾注平皿和再現性檢測結果所帶來的不確定度因素。

2.2 不確定度分量

根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）中規定，樣品制備中使用的量筒和分度吸管等玻璃量具均有相應的最大允差，見表1[6-7]。

表1 玻璃量具的最大允差

2.2.1 次級取樣引入的不確定度

以無菌吸管吸取25 mL 樣品置于225 mL 生理鹽水均質袋中，充分混勻，制成1 ∶10 的樣品勻液；次級取樣過程中使用的玻璃量具為A 級25 mL分度吸管和量出式250 mL 量筒，由表1 可知，A 級25 mL 分度吸管引入的標準不確定度為：

吸取25 mL 樣品引入的相對標準不確定度為：

量出式250 mL 引入的標準不確定度為：

量取225 mL 生理鹽水引入的相對標準不確定度為：

則次級取樣引入的相對標準不確定度為：

2.2.2 倍比稀釋引入的不確定度

用1 mL 無菌吸管吸取樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入9 mL 生理鹽水試管中，振搖試管混合均勻，制成1 ∶100 的樣品勻液，倍比稀釋；此過程使用的玻璃量器為A 級1 mL 分度吸管和A 級10 mL 分度吸管，同2.1.1。

A 級1 mL 分度吸管引入的標準不確定度為：

吸取1 mL 樣品稀釋液引入的相對標準不確定度為：

A 級10 mL 分度吸管引入的標準不確定度為：

吸取9 mL 生理鹽水引入的相對標準不確定度為：

本實驗每個樣品做3 個稀釋度，因此倍比稀釋2 次，則倍比稀釋引入的相對標準不確定度

2.2.3 傾注平皿引入的不確定度

分別吸取1 mL 樣品勻液于兩個無菌平皿內，及時將約20 mL 冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻；本實驗不考慮培養基的體積和溫度所引入的不確定度，所以此過程的不確定度僅為A 級1 mL 分度吸管所引入，3 個稀釋度，每個稀釋度做2 個平行，共引入6 次，則傾注平皿引入的不確定度為

2.2.4 再現性檢測引入的不確定度

通過不同時間的兩次實驗（以A 和B 表示），對10 個樣品的檢測結果見表2，依照標準，先將檢測結果的單位從CFU/mL 轉換為lg(CFU/mL)，再計算再現性標準差SR。

表2 再現性檢測引入的不確定度

2.3 合成標準不確定度

2.4 擴展不確定度U

在 包 含 因 子 為2（ 置 信 水 平95%）時，U=2uc(y)=0.094 lg(CFU/mL)。

2.5 結果報告

本次雪糕中的菌落總數檢測結果平均值為8 600 CFU/mL，對數形式表示為2.9 lg(CFU/mL)；按照食品微生物學測量不確定度評估指南，本次測量不確定度結果是8.6×103CFU/mL[6.4×102，9.8×102]，以對數形式表示為（2.9±0.094）lg(CFU/mL)。

3 結論

食品中微生物檢測由于自然污染物的不規律分布及動態變化特點，造成同一批次的獨立樣品間檢測結果差異顯著。本次檢測未能引入的分量，在日常檢測中應考慮到其對檢測結果的影響。如無菌室的潔凈度、商品化即用型培養基、檢測使用的設備及實驗人員的技術水平等。只有時刻保持細致嚴謹的工作態度，才能完成上述所有質量控制工作，進而對不同基質的多個檢測項目進行不確定度的評定。