Central-Composite Design 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于金盞菊提取工藝的研究

時(shí) 宇，成永燕，劉芷萱，劉睿姿，孫 政，遲夢(mèng)辰

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），齊魯制藥集團(tuán)有限公司，山東濟(jì)南 250000）

金盞菊為來(lái)源于菊科盞菊屬植物金盞菊的干燥全草，具有清熱解毒、涼血調(diào)經(jīng)之功效[1-2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金盞菊具有良好的抗炎、抗菌及抗氧化作用，被廣泛用于食品、化妝品及醫(yī)療領(lǐng)域。金盞菊中主要包含黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[3]。有效成分作為中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，如何最大限度地提取藥材中的有效成分是充分利用中藥的首要前提。因而，其提取工藝的研究成為中藥制劑研究的重要內(nèi)容之一。

在提取工藝的優(yōu)化過(guò)程中，需要考察不同因素、不同水平對(duì)有效成分提取效率的影響，該過(guò)程往往是涉及多因素、多水平、多目標(biāo)的復(fù)雜過(guò)程，而目前應(yīng)用較多的優(yōu)化方法大多采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不能全面、綜合地反映提取工藝的優(yōu)劣。中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）作為效響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種，通過(guò)建立因素與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)擬合方程，能夠結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析尋求最佳工藝參數(shù)。近年來(lái)，該方法被廣泛用于藥材的提取工藝及處方設(shè)計(jì)的優(yōu)化研究中[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)擬采用中心組合設(shè)計(jì)，以金盞菊中有效成分總黃酮及浸出物為考察指標(biāo)，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期確定金盞花的最佳提取工藝，為金盞菊開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電子天平[BT25S，賽多利斯儀器（北京）有限公司]；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；紫外可見(jiàn)光分光度計(jì)（UV-8000A，上海元析儀器有限公司）。

金盞菊藥材購(gòu)于漱玉平民大藥房，經(jīng)鑒定為菊科植物金盞菊的全草；蘆丁對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)100080-202012）；無(wú)水乙醇、三氯化鋁等所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金盞菊提取工藝條件CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)中心組合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，利用Design-Expert?軟件以總黃酮得率及浸膏得率為響應(yīng)值，以藥材與提取溶劑的比例（料液比）、乙醇濃度、提取溫度為自變量，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)金盞菊的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。金盞菊提取工藝條件CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平見(jiàn)表1。

表1 CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.2 供試品溶液配制

精密稱(chēng)取金盞菊藥材粉末5.0 g，按照表2 中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排分別加入不同濃度的乙醇溶液，回流提取2 次，濾過(guò)后合并兩次濾液定容至250 mL 容量瓶中，作為供試品溶液備用。

1.2.3 浸膏得率的測(cè)定

精密量取1.2.2 項(xiàng)下供試品溶液10.0 mL 置于已知質(zhì)量（M1）的蒸發(fā)皿中，水浴加熱蒸干，105 ℃烘箱中干燥4 h 直至恒重（M2），則浸出物的質(zhì)量為M2-M1。因此，

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定

（1）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品4.04 mg 置于10 mL 容量瓶中，乙醇溶解并稀釋至刻度，制備成濃度為0.404 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備。分別精密量取（1）項(xiàng)中蘆丁對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加入1%三氯化鋁乙醇溶液5.0 mL，乙醇定容至刻度。隨后置于50 ℃水浴中顯色10 min[6]。以乙醇作為空白，在200 ～800 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為418 nm。在418 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

（3）供試品溶液的測(cè)定。精密量取1.2.2 項(xiàng)下供試品溶液5.0 mL，加入1%三氯化鋁乙醇溶液5.0 mL，50 ℃水浴中顯色10 min。以乙醇作為空白，于418 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為A=23.418C+0.017 6(R=0.999 7)。結(jié)果表明，蘆丁在8.08 ～40.40 μg/mL 線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密移取蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL 于容量瓶中，按1.2.3（2）項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，測(cè)定其吸光度值，連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算RSD 值為0.82%，表明儀器精密度良好。將上述溶液每隔15 min 測(cè)定其吸光度考察穩(wěn)定性，計(jì)算RSD 值為1.79%，表明該顯色反應(yīng)在2 h 內(nèi)穩(wěn)定。取同一批次樣品6 份，按上述方法進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算RSD 值為1.31%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知黃酮含量的金盞菊粉末6 份，每份0.5 g，精密稱(chēng)定，加入蘆丁對(duì)照品2.5 mg，按照供試品溶液制備方法及顯色方法操作，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明平均回收率為96.5%，RSD為2.35%。

2.4 最佳提取工藝條件的確定

根據(jù)Design expert 軟件所安排的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總黃酮含量及浸膏得率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果安排表

將所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析并擬合數(shù)學(xué)模型，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)值模型方程擬合結(jié)果

由回歸方程模型的R2值及P值可知，二項(xiàng)式方程模型的擬合度和可信度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。以總黃酮含量為考察指標(biāo)時(shí)，其方程為：Y1=0.672 1+0.038 0X1+0.18 10X2+0.052 0X3+0.010 0X1X2+0.007 5X1X3+0.042 5X2X3-0.026 2X12-0.051 2X22+0.003 8X32（R2=0.882 1）。以浸出物得率為考察指標(biāo)時(shí)，其回歸方程為：Y2=4.52+0.363 0X1+0.181 0X2+0.101 0X3+0.240 0X1X2+0.012 5X1X3-0.087 5X2X3+故可用上述模型方程分析和預(yù)測(cè)金盞菊的提取工藝。

根據(jù)所擬合的二項(xiàng)式方程，繪制各考察因素對(duì)總黃酮和浸膏得率的三維效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖1 可知，隨乙醇濃度的增加，總黃酮含量呈顯著增加趨勢(shì)，而料液比及提取時(shí)間對(duì)其影響不大，曲面上升趨勢(shì)較為平緩，這可能與黃酮在高濃度乙醇中溶解度較大有關(guān)，同時(shí)因?yàn)榻鸨K花質(zhì)地較為疏松，提取溶劑容易滲透到藥材內(nèi)部，會(huì)更快達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，故料液比及提取時(shí)間對(duì)總黃酮的提取影響不大。

圖1 料液比、乙醇濃度及提取時(shí)間對(duì)金盞菊總黃酮提取率影響的三維效應(yīng)曲面圖

圖2 料液比、乙醇濃度及提取時(shí)間對(duì)金盞菊浸膏得率影響的三維效應(yīng)曲面圖

由圖2 可知，乙醇濃度及料液比對(duì)浸膏得率的影響呈現(xiàn)馬鞍狀分布，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。

由預(yù)先設(shè)定的限定條件，即希望總黃酮含量及浸膏得率保持最大浸出量，分析料液比、乙醇濃度及提取時(shí)間對(duì)金盞菊提取工藝的影響。由Design expert軟件確定金盞菊的最優(yōu)提取工藝條件為藥材與溶劑的比例為1 ∶12，乙醇濃度為68%，提取時(shí)間為1.8 h，共提取兩次。在此條件下，總黃酮含量和浸膏得率的預(yù)測(cè)值分別為0.86%和5.16%。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可靠性，所得到的金盞菊總黃酮含量和浸膏得率分別為0.83%和5.12%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)模型具有良好的可靠性。

3 結(jié)論

中心組合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠更全面地表征各工藝參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，尤其是適合于多因素連續(xù)變量對(duì)響應(yīng)值的影響[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，利用CCD響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將總黃酮含量及浸膏得率作為響應(yīng)值，將其限定為“最大值”進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)數(shù)學(xué)模型擬合獲得最優(yōu)提取工藝條件，能夠克服正交實(shí)驗(yàn)及均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)單一線(xiàn)性模型的不足。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金盞花最佳提取工藝條件為藥材∶溶劑（1∶12），乙醇濃度68%，提取時(shí)間1.8 h，提取兩次，此條件下總黃酮含量和浸膏得率的預(yù)測(cè)值分別為0.86%和5.16%。該最佳工藝能夠較大程度提高金盞菊中指標(biāo)成分的提取效率，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用及產(chǎn)品深加工提供理論基礎(chǔ)及實(shí)踐依據(jù)。