原料乳中三聚氰胺快速檢測高效液相色譜法方法驗證

寇永麗，郭 瑞

（大同市綜合檢驗檢測中心，山西 大同 037000）

2008 年的“三聚氰胺事件”轟動全國,產生了惡劣的社會影響。三聚氰胺（melamine），化學式為C3N3（NH2）3，被命名為1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺,是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，三聚氰胺分子中含氮量達66.7%,一些不法企業將其添加到牛奶、乳制品中,造成粗蛋白質虛高的假相,不僅對乳制品、養殖業等產業產生不利影響,對人類健康也構成嚴重威脅[1]。臨床試驗表明，動物長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿系統的損害及腎結石，并可進一步誘發膀胱癌[2]。目前，三聚氰胺已嚴禁直接用于食品。國家頒布法律法規強調企業在購入生乳原料和原料乳粉及其加工制品時需檢測三聚氰胺含量[3-4]。國家質檢總局出臺了國家標準檢測方法：《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》（GB/T 22388—2008）和《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》（GB/T 22400—2008）。

通過陽性添加回收試驗驗證《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》（GB/T 22400—2008）的精密度、重復性、回收率、檢測限，得出GB/T 22400-2008方法可以快速準確地對生鮮乳中三聚氰胺含量進行檢測，適合應用于大批量檢測。

1 試驗流程

使用方法為《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》（GB/T 22400—2008）。待測樣品經乙腈的提取后[5]，經陽離子交換色譜柱分離，經有機濾頭過濾后，用高效液相色譜檢測，外標法定量。

2 試驗方法

2.1 試驗試劑與材料

供檢測樣品為某地區生鮮乳；乙腈（色譜純），默克化工技術（上海）有限公司生產；磷酸（優級純），天津市風船化學試劑有限公司生產；磷酸二氫鉀（分析純），國藥集團化學試劑有限公司生產；三聚氰胺標準品（純度≥99%），阿爾塔科技有限公司生產。

磷酸鹽緩沖液：準確稱取6.8 g（精確至0.01 g）磷酸二氫鉀，加入約800 mL 水溶解，用磷酸調節pH 至3.0，定容至1 L，過濾膜抽濾后備用。

2.2 試驗儀器

高效液相色譜儀（Waters e2695），沃特斯科技（中國）有限公司生產；多管渦旋振蕩器，北京踏錦科技有限公司生產；分析天平（MS303TS），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產。

2.3 標準曲線

稱取100 mg（精確至0.1 mg）三聚氰胺標準物質，用水完全溶解后，100 mL 容量瓶中定容至刻度，混勻，即可得到1 000 mg/L 的標準儲備液。將1 000 mg/L 的標準儲備液用水適當稀釋，得到100 mg/L的三聚氰胺標準工作液。

將100 mg/L 的三聚氰胺標準工作液，用水適當稀釋后制得濃度為0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的三聚氰胺系列標準品溶液。

2.4 儀器參數

2.4.1 色譜柱

SCX 柱，250 mm×4.6 mm（內徑），5 μm，安捷倫科技（中國）有限公司。

2.4.2 參數設置

進樣量：20 μL；波長：240 nm；柱溫：40℃；流速：1 mL/min。

2.4.3 流動相

磷酸鹽緩沖液-乙腈（70+30，體積比）。

2.5 具體步驟

稱取15 g（精確至0.01 g）生鮮乳試樣于50 mL離心管中，加入30 mL 乙腈，劇烈震蕩6 min，加水定容至滿刻度，充分混勻后靜置3 min，用一次性注射器吸取上清液0.22 μm 有機濾頭過濾后上機測定。

3 試驗結果

3.1 工作曲線

配制濃度為0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L 的三聚氰胺系列標準工作液進行分析，得到2條標準曲線（見圖1、圖2）：標準曲線（低濃度）、標準曲線（高濃度）。

圖1 三聚氰胺低濃度標準工作曲線Fig.1 The standard working curve of low concentration of melamine

圖2 三聚氰胺高濃度標準工作曲線Fig.2 The standard working curve of high concentration of melamine

結果表明，三聚氰胺分別在0.005～0.2 mg/L、0.2～50.0 mg/L濃度范圍內線性關系良好。線性方程分別為：

3.2 檢出限

方法中給出檢出限為0.05 mg/kg，進行了6次平行添加試驗，結果均可檢出，結果見表1。

表1 三聚氰胺方法檢出限陽性添加回收試驗Tab.1 The melamine method detection limit positive addition recovery

3.3 定量限

取三聚氰胺陰性生鮮乳15 g，加入濃度為10.0 mg/L 的三聚氰胺標準溶液750 μL，獲得添加濃度為0.5 mg/kg的待測樣品,添加同樣的待測樣6 個平行，按照2.5 具體步驟樣品進行前處理，測定，檢測結果見表2，結果表明，三聚氰胺的平均回收率為90.0%，RSD值為1.04%，說明此方法可以對陽性含量為0.5 mg/kg的試樣準確定量。

表2 三聚氰胺定量限陽性添加回收試驗（n=6）Tab.2 The melamine quantitative limit positive addition recovery test

3.4 精密度

取三聚氰胺陰性生鮮乳15 g，加入濃度為10.0 mg/L 的三聚氰胺標準溶液1.50 mL，獲得添加濃度為1.0 mg/kg 的待測樣品，添加同樣的待測樣6 個平行，按照2.5 具體步驟樣品進行前處理，測定，檢測結果見表3，結果表明，三聚氰胺的平均回收率為96.7%，RSD值為6.16%，精密度良好。

表3 三聚氰胺精密度陽性添加回收試驗（n=6）Tab.3 The melamine precision positive addition recovery test

3.5 重復性

表4 三聚氰胺重復性陽性添加回收試驗（n=6）Tab.4 The melamine repeated positive addition recovery test

取三聚氰胺陰性生鮮乳15 g，加入濃度為100.0 mg/L 的黃曲霉毒素標準溶液750 μL，獲得添加濃度為5.0 mg/kg的待測樣品，添加同樣的待測樣6 個平行，按照2.5 具體步驟樣品進行前處理，測定，檢測結果見表4，結果表明，三聚氰胺的平均回收率為96.0%，RSD值為6.26%，重復性良好。

4 結論

通過陽性添加回收試驗，對《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》（GB/T 22400—2008）進行驗證，結果表明，該方法的精密度、重復性良好；在添加濃度為0.5～5 mg/kg時，平均回收率可達到90%以上；陽性添加檢測限濃度均可檢出；陽性添加定量限濃度均可準確定量。因此，得出GB/T 22400—2008方法可以快速準確地對生鮮乳中三聚氰胺含量進行檢測，適合應用于大批量檢測。