酒石酸亞鐵- 標準曲線法對沙棘茶中茶多酚含量的測定

楊若熙 王貝* 劉桂艷

（武漢華夏理工學院生物與制藥工程學院，湖北武漢 430223）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.），是胡頹子科沙棘屬落葉性灌木，沙棘葉中富含大量的多酚、黃酮、萜類化合物，因此具有較好的醫藥價值和保健價值[1]。根據研究，沙棘是一種潛在的抗氧化劑物質，可以延緩許多與自由基相關的疾病[2]。茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱，具有強效殺毒和抗菌作用，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、DNA病毒及RNA病毒都具有抑制其活性的作用。且茶多酚無毒副作用、對機體無刺激[3]。茶多酚的組成一般有表兒茶素與表沒食子兒茶素類, 因為兒茶素結構中的氫氧基團在苯核中的位置不同,會形成鄰苯二酚基、連苯三酚基,，還有沒食子酸的酯型結合物，所以也可采用酒石酸亞鐵- 標準曲線法計算沙棘茶葉中茶多酚的濃度[4]。其主要作用原理是酒石酸亞鐵溶液能與茶多酚中的鄰連位羥基官能團發生顯色反應，而對間位羥基和單羥基不發生顯色反應，反應后形成紫褐色配位化合物，在可見光區有特定的波長吸收。酒石酸亞鐵比色法具有反應快速、精密性高、操作簡便等特點，用此方法對沙棘茶葉中茶多酚進行含量測定，為沙棘資源的開發利用提供依據。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

沙棘茶葉，購自中國新疆先農伯益生物科技技術公司；沒食子酸，國藥集團化學試劑有限公司；L- 酒石酸鉀鈉四水合物、七水合硫酸亞鐵、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

FA214 型電子天平，上海海康電子儀器廠；UV-1200型紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；HH-2數字顯示恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；TU-1900 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義市子華儀器有限責任公司。

1.2 標準液的制備

精密稱取0.110 6g沒食子酸標準品，加蒸餾水適量，攪拌溶解至溶液澄清后轉移至100mL 容量瓶中定容至100mL，搖勻，即得1 mg/mL沒食子酸標準溶液[6]。

精密稱取0.101 0gFeSO4·7H2O 、0.500 5g四水合酒石酸鉀鈉，加蒸餾水適量，經充分攪拌溶解后轉移至100mL容量瓶中定容至100mL，搖勻，即得黃綠色酒石酸亞鐵溶液。

精密稱取23.337 0gNa2HPO4·12H2O，加蒸餾水后快速攪拌，溶解后轉移至1000mL容量瓶中定容即得磷酸鹽A液，稱取KH2PO40.907 8g，同理，轉移至100mL 容量瓶中定容即得磷酸鹽B液，將所得磷酸鹽A液、B液按配比取不同體積混勻后，即得不同pH 的磷酸鹽緩沖溶液。

1.3 供試液的制備

稱取5g沙棘茶葉置于250mL圓底燒瓶中，加入沸蒸餾水150mL，于90℃水浴中浸提40min，浸提結束后趁熱進行減壓抽濾，棄去濾渣，將濾液轉移至棕色試劑瓶中，等待冷卻。

1.4 茶多酚含量測定條件的優化

1.4.1 最大吸收波長的確定。精密量取1 mg/mL沒食子酸標準液0、0.75、1.00、1.25mL 置于25ml 具塞比色管中，用酒石酸亞鐵比色法測定[5-6]。依次添加4mL蒸餾水、5mL酒石酸亞鐵溶液、用pH=7.5 的磷酸鹽緩沖液定容至刻度，振搖多次使其混勻，以不加沒食子酸標準溶液組作為對照，在400-800nm檢測確定該溶液的最大吸收波長。

1.4.2 單因素實驗。選取3 個主要干擾因素分別開展單因素實驗。固定各主要干擾因素含量值不變的反應條件下，探究蒸餾水用量（2、4、6、8、10mL），酒石酸亞鐵溶液用量（1、3、5、7、9ml）,磷酸鹽緩沖液pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）三個因素對茶多酚含量測定值的影響，以吸光度為主要評價指標篩選出各主要干擾反應因素的最優反應條件。

1.4.3 正交實驗。根據上述單因素實驗結論，以茶多酚含量測定的最優反應條件組合為重點考察指標，選擇蒸餾水用量（A）、酒石酸亞鐵溶液用量（B）、磷酸鹽緩沖液pH(C)作為考察因素[7]，進行L9(34)正交實驗。

1.4.4 線性關系的考察。取其在最大吸收波長處的最大吸收波長值，依次測定溶液吸光度（A）。以含沒食子酸標準品組濃度（C, μg/mL）為曲線的橫坐標，吸光度（A）為曲線的縱坐標，繪制標準曲線。

1.5 酒石酸亞鐵- 標準曲線法測定茶多酚

1.5.1 沙棘茶中茶多酚的含量測定。用移液管吸取棕色試劑瓶中待測溶液1mL至25mL具塞比色管中，再添加蒸餾水4mL、酒石酸亞鐵溶液5mL，用ph=7.5 的磷酸緩沖液定容至刻度,蓋上蓋子，振蕩搖勻。以不含茶多酚組做空白對照，在540nm 處測定其吸光度（A），將測定結果代值入1.4.4 節中所繪制的標準曲線中，可計算其待測樣品中茶多酚含量[8]。

1.5.2 精密性實驗。稱取5g干燥沙棘茶葉，按1.3 節方法制備供試品溶液，用酒石酸亞鐵- 標準曲線法對供試品溶液進行茶多酚含量測定，重復5 次測定實驗，求出沙棘茶葉中茶多酚的含量，計算相對標準偏差(RSD)。

1.5.3 穩定性實驗。用酒石酸亞鐵- 標準曲線法對供試品待測液進行穩定性實驗，量取一定體積的供試品液于具塞比色管中，按1.4.3 節所示最優反應組合添加試劑，每間隔一段時間檢測一次，檢驗時間(min)對吸光度（A）的影響。

1.5.4 加標回收實驗。取相同體積供試液，分別加入質量分數為供試液80%、100%、120%的沒食子酸，用酒石酸亞鐵- 標準曲線法測定吸光度，重復3 次實驗操作，以求得加標后回收率。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 蒸餾水用量的影響。在恒定酒石酸亞鐵溶液用量、磷酸鹽緩沖液pH 的情況下，改變蒸餾水用量，由于體系內磷酸鹽緩沖液的存在，使溶液pH 長期處在相對平衡的狀態，但隨著蒸餾水用量變化的進一步增加，溶液吸光度已無顯著改變。因此，可首先根據具塞比色管定容所需體積再選取蒸餾水用量，故選擇4mL蒸餾水為實驗測定條件。

2.1.2 酒石酸亞鐵溶液用量的影響。在其余單因素條件恒定的情況下，改變酒石酸亞鐵溶液用量對吸光度（A）變化有顯著的影響，其影響規律結果見圖1 所示。酒石酸亞鐵溶液作為反應的顯色劑，當其溶液用量較不足時，吸光度變化較為不明顯；相反，當酒石酸亞鐵溶液用量逐漸增加時，吸光度（A）呈現急劇上升的態勢；由此可得，顯色劑在反應中作用較為重要。然而當顯色劑溶液用量大于5mL時，吸光度（A）逐漸呈現穩定地態勢。由于含酒石酸亞鐵溶液的溶液組分物中含有金屬亞鐵離子，在微堿性溶液介質中會較易發生氧化, 同時過量經稀釋所得的含酒石酸亞鐵的酸性溶液濃度也可能會由此造成對實驗研究結果、所得測定數據中吸光度產生間接干擾，故選擇5mL酒石酸亞鐵溶液為實驗測定條件。

圖1 酒石酸亞鐵溶液用量的影響

2.1.3 磷酸鹽緩沖液pH 的影響。磷酸鹽緩沖液pH 對吸光度（A）的影響結果見圖2 所示。可知，緩沖液為溶液中定容的溶液，整個反應體系的主要反應介質，影響整個體系的pH 值。pH 的變化對與Fe2+形成藍紫色配位化合物有較大影響。由圖2 可知，吸光度隨pH 的增大而增大。按照光度誤差的要求，測定的吸光度，應該在0.2～0.8 的范圍內。由于pH＞8.0 的溶液體系會引起茶多酚化合物氧化的進一步氧化，而pH=7.5 時反應較為穩定，所以選擇實驗測定條件的磷酸鹽緩沖液為pH=7.5。

圖2 磷酸鹽緩沖液pH 的影響

2.2 正交實驗結果分析

表1 和表2 為正交實驗結果和方差分析結果。極差值（R）越大，該因素的水平變動對實驗的影響越大，由表2 可知，三因素對沙棘茶中茶多酚的含量測定影響的順序是磷酸鹽緩沖液（C）＞酒石酸亞鐵溶液用量（B）＞蒸餾水用量（A）。由表3 可知，三因素對沙棘茶中茶多酚含量測定的影響只有磷酸鹽緩沖液有顯著性差異（P＞0.1）。綜上所示，根據2.1 節中所述單因素水平試驗的結論，綜合考慮最優反應條件組合為A2B2C2，即蒸餾水4mL、酒石酸亞鐵溶液5mL、pH7.5 的磷酸鹽緩沖液[9]。

表1 正交實驗結果

表2 正交實驗方差分析結果

2.3 方法驗證結果

2.3.1 最大吸收波長與線性關系。圖3 所示為在其他干擾因素水平恒定的條件下，加入不同體積的沒食子酸標準溶液液的可見光吸收曲線。由圖3 中可得知：由于沒食子酸溶液加入體積量的增大，溶液中沒食子酸的含量增加，最大吸收波長（λ） 也略增大，測定的最大吸收波長為538-540nm，相對穩定。因此，選擇540nm進行測定。

根據1.4.4 節中所述方法，求得含沒食子酸標準品溶液的線性回歸標準曲線方程式為：Y=0.0184X+0.0186(r=0.9997)。沒食子酸標準曲線見圖3，結果表明在10-50μg/mL內具有良好的線性關系。

圖3 可見光吸收光譜圖

2.3.2 精密性。精密性的相對標準偏差（RSD）可接受限度一般為2.0%，表3 為酒石酸亞鐵- 標準曲線法的精密性測定實驗結果。由表3 可知：酒石酸亞鐵- 標準曲線法測定沙棘茶中茶多酚的含量精密性的RSD在可接受范圍內。

表3 酒石酸亞鐵- 標準曲線法的精密性

2.3.3 穩定性。酒石酸亞鐵- 標準曲線法有較好的穩定性，由于穩定性實驗過程所需要時間較長，沒食子酸和酒石酸亞鐵發生進一步的氧化，隨著時間（t）的增加，吸光度呈現微小的降低趨勢，所以實驗所需溶液需要現配現用后直接檢測。

2.3.4 加標回收率。酒石酸亞鐵- 標準曲線法測定茶多酚含量的加標回收率實驗結果見表4。由此可知，加標回收率結果在回收率限度內。

表4 酒石酸亞鐵- 標準曲線法的加標回收率實驗

3 結論

沙棘具有生態效益、社會效益與經濟效益，且沙棘茶葉中含有豐富的茶多酚，具有很高的開發利用價值。酒石酸亞鐵- 標準曲線法可有效測定出沙棘茶葉中的茶多酚含量，其含量為1.51mg/g，其基本原理是酒石酸亞鐵溶液作為顯色劑與茶葉提取液中茶多酚發生顯色反應，得到較為穩定的深紫褐色絡合物，且反應后溶液顏色的深淺與溶液中茶多酚的含量成正比關系。該法是用無水沒食子酸為標準品配置對照品溶液，以酒石酸亞鐵作為反應的顯色劑，方法精密度高、穩定性強、操作簡便，最佳的測定條件組合是蒸餾水4mL、酒石酸亞鐵5mL、pH=7.5 的磷酸鹽緩沖液。用本法進行茶多酚的含量測定操作簡單，線性范圍寬，易于推廣使用。