人血清PCT直接化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立及性能評價①

楊進波 焦 蓉 孫 莉 曹 琳 武軍駐 童 偉

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，襄陽 441000）

降鈣素原（procalcitonin，PCT）是降鈣素前體，分子量約為13 kD，由甲狀腺C 細胞分泌形成，包含降鈣蛋白、降鈣素與N 殘基片段［1］。研究表明，PCT 在診斷膿毒癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征與急性呼吸窘迫綜合征等疾病時具有較高的敏感性與特異性［2］。PCT作為一項重要炎癥指標，在疾病輔助診斷治療、指導(dǎo)抗生素使用方面具有重要價值［3］。PCT 的半衰期一般為25～30 h，相比IL-6、TNF-α 等半衰期只有數(shù)分鐘至幾小時的炎癥因子，PCT穩(wěn)定性更好；對比傳統(tǒng)驗證指標C-反應(yīng)蛋白（CRP），患者血漿PCT 濃度在升高2 h 后就可用分析儀檢測，而CRP 在炎癥過程開始8～12 h后才能檢測出來［4-5］。

PCT 作為炎癥指標在醫(yī)院各大科室應(yīng)用廣泛，目前許多醫(yī)院檢測PCT 以熒光免疫層析法為主，該方法勝在設(shè)備體積小巧，且定量靈敏度遠高于同類膠體產(chǎn)品，特別適合科室及小型醫(yī)院使用［6］。化學(xué)發(fā)光法雖在靈敏度、準確度、特異性等方面性能優(yōu)異，但其設(shè)備往往非常龐大，對于科室與小型醫(yī)院并不友好［7］。國產(chǎn)化學(xué)發(fā)光分析儀器的發(fā)展迅速，應(yīng)市場需求，近幾年衍生出面向科室的中小型化學(xué)發(fā)光儀器，如國賽公司Kemilo POCT 化學(xué)發(fā)光分析儀、萬孚公司POC 全自動磁微粒化學(xué)發(fā)光儀以及科斯邁公司SMART 500 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀等。這些儀器兼具體積小與化學(xué)發(fā)光平臺性能出眾的特點，其中科斯邁SMART 500 儀器為全開放式系統(tǒng)，可直接設(shè)置各類參數(shù)進行調(diào)試，本研究選擇該設(shè)備作為研究設(shè)備，根據(jù)PCT 雙抗體夾心法原理成功建立人血清PCT 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，對該方法各項參數(shù)進行優(yōu)化，并與目前醫(yī)院正在穩(wěn)定使用的熒光免疫檢測系統(tǒng)進行相關(guān)性比對。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本 158 份不包含抗凝劑的空腹血采集自襄陽市第一人民醫(yī)院，常溫靜置20～40 min，待血液完全凝固后以3 000 r/min 離心20 min，收集上清液即為血清，保存至-20 ℃以下待用。所有標本采集于2020年11月至12月。

1.1.2 主要試劑與儀器 配對PCT 捕獲抗體與檢測抗體均購自金斯瑞公司（Ab-1：克隆號16A1、IgG1亞類；Ab-2：克隆號12C5、IgG2b 亞類；Ab-3：克隆號E72、IgG1 亞類）；重組PCT 抗原購自啟泰生物（來源：E.coli；分子量16.1 kD）；吖啶酯、牛血清白蛋白（BSA）、ProClin 300 購自Sigma 公司；鏈霉親和素磁珠購自重慶博藍鷹生物技術(shù)有限公司；降鈣素原檢測試劑盒（干式免疫熒光法）購自基蛋公司，醫(yī)療器械注冊證編號：蘇械注準20162401534，批號：P018210025，4～30 ℃密封保存，有效期為18 個月。SMART 500 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自科斯邁公司（渝械注準20192220077）；Getein1600全自動熒光免疫定量分析儀購自基蛋公司（蘇械注準20142220013）；BY-L600型離心機購自白洋醫(yī)療器械公司；凍干機購自四環(huán)儀器；移液器購自大龍公司。

1.2 方法

1.2.1 磁微粒試劑的制備 采用含1%BSA 的0.01 mol/L 的Tris 緩沖液（pH=7.4）將鏈霉親和素磁珠稀釋到0.4 mg/ml，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 吖啶酯標記PCT 檢測抗體 PBS（pH=7.4）透析置換抗體緩沖體系，調(diào)整抗體濃度為1 mg/ml。吖啶酯用無水N，N-二甲基甲酰胺配制成3 mg/ml溶液。取500μl抗體溶液，加入一定量的吖啶酯溶液，室溫避光振蕩反應(yīng)40 min，G25 脫鹽純化柱純化，加入等體積甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生物素化PCT抗體制備 PBS（pH=7.4）透析置換抗體緩沖體系，調(diào)整PCT 抗體濃度為1 mg/ml。N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯用無水N，N-二甲基甲酰胺配制成5 mg/ml 溶液。將N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯溶液按照一定投料摩爾比加入PCT 抗體溶液中，室溫反應(yīng)30～60 min，結(jié)束后加入賴氨酸終止反應(yīng)20 min，脫鹽柱除去體系中多余生物素結(jié)合物，加入等體積甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCT 校準品制備 PCT 無國家標準品，本研究將PCT 校準品定值溯源至行業(yè)公認測量程序（即基蛋公司PCT 免疫熒光檢測系統(tǒng)），具體配制與溯源過程如下：準確量取一定量的PCT 抗原，溶于含0.5%BSA 的PBS 緩沖液，制成PCT 校準品濃縮液，Getein1600 全自動熒光免疫定量分析儀校準后標定PCT校準品濃縮液濃度，向含0.5%BSA的PBS緩沖液中分別加入不同量的PCT 校準品濃縮液，制成濃度分別為0、0.5、1.6、7.0、30.0、100.0 ng/ml 的PCT校準品溶液，使用儀器對每個濃度點進行測試，除零校準點外，其他濃度點偏差應(yīng)在10%范圍內(nèi)。每個濃度點各分裝1 ml 于凍存管中，凍干48 h 制備成凍干粉校準品，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 檢測程序設(shè)定 SMART 500 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀設(shè)定檢測程序，反應(yīng)杯中加入20μl樣本、生物素化PCT 抗體、吖啶酯標記的PCT 抗體，37 ℃恒溫孵育15 min 形成生物素-PCT 捕獲抗體-抗原-PCT 檢測抗體-吖啶酯復(fù)合物，加入磁微粒試劑，孵育5 min。磁場吸引復(fù)合物，清洗液洗滌，加入100 μl 預(yù)激發(fā)液、100 μl 激發(fā)液。免疫復(fù)合物中吖啶酯在2 種試劑作用下形成激發(fā)態(tài)中間體，激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)出恒定波長可見光，化學(xué)發(fā)光免疫分析儀傳感器可檢測發(fā)光強度。發(fā)光強度與血清PCT濃度在一定線性范圍內(nèi)成正比，四參數(shù)Logistic方程擬合后即可計算血清樣本中PCT的濃度。

1.2.6 配對抗體篩選 3 株P(guān)CT 抗體（Ab-1、Ab-2、Ab-3）分別用生物素、吖啶酯標記，兩兩交叉配對實驗，建立標準曲線評估每對抗體的標曲相關(guān)系數(shù)r；選取PCT 陽性樣本、陰性樣本各1份，用初步建立的方法測定陽性樣本與陰性樣本的儀器發(fā)光值比值（P/N），見表1。

表1 配對抗體篩選Tab.1 Matched antibody pairs screening

1.2.7 生物素化PCT 捕獲抗體濃度及工作濃度的篩選 采用棋盤實驗法。生物素與PCT 捕獲抗體進行偶聯(lián)，分別按照7.5∶1、15∶1、30∶1 的摩爾比偶聯(lián)（因素A）。每個生物素偶聯(lián)物的工作濃度分別按照1∶50、1∶100、1∶200 的比例稀釋（因素B），采用雙因素交叉實驗評估校準品擬合的線性及信噪比（S1/S0），見表2。

表2 生物素化PCT捕獲抗體濃度及稀釋比例選擇Tab.2 Selection of biotinylated PCT capture antibody concentration and dilution ratio

1.2.8 吖啶酯標記PCT 檢測抗體濃度及工作濃度的篩選 采用棋盤實驗法。吖啶酯與PCT 檢測抗體標記，分別按照5∶1、10∶1、20∶1的摩爾比標記（因素A）。每個濃度的標記物工作濃度分別按照1∶250、1∶500、1∶1 000 稀釋（因素B）。雙因素交叉實驗評估校準品擬合的線性和信噪比（S1/S0），見表3。

表3 標記物濃度及稀釋比例的選擇Tab.3 Selection of marker concentration and dilution ratio

1.2.9 反應(yīng)時間選擇 確定生物素偶聯(lián)PCT 捕獲抗體、吖啶酯標記PCT 檢測抗體工作濃度，進一步探究最佳的反應(yīng)時間。設(shè)定反應(yīng)時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min，評估不同時間下校準品的回歸曲線，見圖1。

圖1 不同反應(yīng)時間校準品相對發(fā)光值Fig.1 Relative luminescence value of calibrator under different reaction times

1.2.10 準確度試驗 將已標定濃度的PCT 抗原母液稀釋至100 ng/ml，濃度記為Xs；取低值血清樣本與參考品（抗原母液配制）以9∶1 的體積比混合，分別檢測低值血清樣本與混合樣本，每個樣本重復(fù)檢測3 次，計算檢測結(jié)果的平均值（X0 與X）。根據(jù)公式P=（10X-9X0）/Xs×100%計算出回收率P。

1.2.11 線性試驗 接近線性范圍上限的高濃度（活性）樣品和接近線性范圍下限的低濃度（活性）樣品混合成至少5 個稀釋濃度（xi）（包括下限、中限及 上 限）。即 配 制 濃 度 為0.02、20.01、40.01、60.01、80.00、100.00 ng/ml 的線性參考品，每個稀釋濃度測試3 次，分別求出測定結(jié)果的均值（yi）。以稀釋濃度（xi）對數(shù)為自變量，測定結(jié)果均值（yi）對數(shù)為因變量擬合線性。

1.2.12 空白限試驗 用零濃度校準品S0 作為樣本進行檢測，重復(fù)測定20 次，得出20 次測量結(jié)果的相對發(fā)光值，計算xˉ和s，將xˉ±2s代入校準品曲線公式，即得本方法空白限。

1.2.13 精密度試驗 配制濃度分別為0.5 ng/ml和10 ng/ml 的樣品，每個實驗重復(fù)10 次，計算批內(nèi)精密度；重復(fù)3 次實驗，以30 次檢測結(jié)果計算批間精密度。

1.2.14 特異性試驗 配制濃度為30 ng/ml 的人鈣抑肽（human katacalcin），10 ng/ml的人降鈣素（human calcitonin），10 000 ng/ml 的人α-降鈣素基因相關(guān)肽（human α-CGRP），10 000 ng/ml 的人β-降鈣素基因相關(guān)肽（human β-CGRP）進行特異性試驗。

1.2.15 與干式免疫法試劑盒的比較試驗 PCT定量檢測試劑與基蛋生物干式免疫法試劑盒分別檢測158份臨床血清樣本，對兩組數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2019 分析，樣本濃度由化學(xué)發(fā)光免疫分析儀通過四參數(shù)Logistic方程擬合得到，線性回歸采用最小二乘法進行直線擬合。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)的建立

2.1.1 配對抗體篩選 結(jié)果顯示，Ab-1 作為捕獲抗體，Ab-3 作為檢測抗體進行配對，所獲得的相關(guān)系數(shù)r和P/N值結(jié)果最好。

2.1.2 生物素化PCT 捕獲抗體濃度及工作濃度篩選 隨PCT 捕獲抗體濃度升高，線性相關(guān)系數(shù)呈升高趨勢。隨生物素濃度升高，信噪比降低。因此根據(jù)PCT 校準曲線線性與信噪比情況，篩選出最優(yōu)的偶聯(lián)條件為：生物素與PCT捕獲抗體摩爾比為15∶1，生物素偶聯(lián)物工作濃度為1∶100，在該條件下線性和信噪比最優(yōu)，且原料用量較少。

2.1.3 吖啶酯標記PCT 檢測抗體濃度及工作濃度篩選 吖啶酯標記PCT 偶聯(lián)物稀釋至1∶500 時信噪比降低，標記物的線性和信噪比達到最優(yōu)。因此，篩選出的最優(yōu)偶聯(lián)條件為：吖啶酯與PCT 檢測抗體摩爾比為10∶1。吖啶酯標記的PCT 偶聯(lián)物的稀釋比例為1∶500 時，校準曲線擬合的線性相關(guān)系數(shù)和信噪比最好，且原料用量較少。

2.1.4 反應(yīng)時間選擇 隨著反應(yīng)時間延長，校準品各個濃度點的相對發(fā)光值也隨之升高，一定時間后基本達到平衡，為實現(xiàn)臨床快速檢測，反應(yīng)時間選擇15 min。

2.2 試劑性能評價

2.2.1 準確度 本方法回收率為95.65%，處于85%～115%范圍內(nèi)，滿足行業(yè)標準中的準確度要求，見表4。

表4 準確度（ng/ml）Tab.4 Accuracy（ng/ml）

2.2.2 線性 PCT 線性回歸方程為y=0.981x+0.658 9，R2=0.999 1，各檢測結(jié)果在（0.02～100）ng/ml范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r＞0.99，表明線性范圍符合行業(yè)標準要求，見圖2。

圖2 線性范圍評估Fig.2 Linear range evaluation

2.2.3 空白限 空白限檢測結(jié)果表明該試劑盒空白限為0.01 ng/ml。

2.2.4 精密度 批內(nèi)、批間精密度結(jié)果見表5、表6，本檢測方法批內(nèi)精密度分別為5.35%、5.06%（＜8%），批間精密度分別為5.69%、5.44%（＜10%），精密度均優(yōu)于行業(yè)標準要求。

表5 批內(nèi)精密度（n=10，ng/ml）Tab.5 Intra-run precision（n=10，ng/ml）

表6 批間精密度（n=30，ng/ml）Tab.6 Inter-assay precision（n=30，ng/ml）

2.2.5 特異性 測定30 ng/ml 人鈣抑肽、10 ng/ml人降鈣素、10 000 ng/ml 人α-CGRP、10 000 ng/ml 人β-CGRP對PCT測定結(jié)果的影響，測值均＜0.05 ng/ml，見表7。說明血清中這幾種特異性物質(zhì)對PCT 檢測不發(fā)生交叉反應(yīng)。

表7 特異性檢測結(jié)果（ng/ml）Tab.7 Specific test results（ng/ml）

2.2.6 與干式免疫法試劑盒比較 二者相關(guān)性方程為y=1.050 1x+0.228 5，R2=0.948 7，見圖3。結(jié)果表明本方法與基蛋生物的干式免疫法檢測系統(tǒng)相關(guān)性較好。

圖3 兩種試劑盒樣本測定結(jié)果相關(guān)性Fig.3 Correlation of test results of two kits

3 討論

PCT 通常由甲狀腺的濾泡旁細胞（C 細胞）及腸、肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生［8］。PCT 前體經(jīng)內(nèi)源多肽酶的酶切作用形成小分子，能以游離形式存在于血清中，發(fā)揮生物學(xué)功能［9］。許多臨床研究結(jié)果表明，機體受細菌性感染后，引起全身炎癥反應(yīng)時，血清PCT 水平顯著升高［10-13］。研究發(fā)現(xiàn)，臨床上PCT的監(jiān)測對嚴重細菌感染與膿毒癥早期診斷更為適用，可更快速地反映治療效果。感染性疾病早期診斷中PCT 檢測較WBC 計數(shù)、C-CRP 白檢測及影像學(xué)檢查具有更好的特異性［14］。PCT作為一種炎癥標志物，是診斷感染性疾病的重要依據(jù)之一，同時對非感染性疾病也具有一定的指導(dǎo)意義，研究表明機體受到病毒性感染時，可產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，釋放特定細胞因子（如IFN-γ），可降低PCT 表達。由于這一選擇性細胞機制，PCT 在辨別細菌性感染與病毒性感染中有重要臨床意義［15］。此外，PCT 亦可指導(dǎo)臨床經(jīng)驗性的抗生素使用，避免濫用抗生素，同時對疾病的發(fā)展過程及轉(zhuǎn)歸進行預(yù)估。在腎移植排斥反應(yīng)及感染中，PCT也有重要的診斷意義［16］。

許多研究者對現(xiàn)有國產(chǎn)化PCT 診斷試劑與進口試劑做過比對研究。楊琴等［17］比較了安圖生物公司PCT 試劑盒與羅氏公司試劑盒，結(jié)果表明二者整體對比相關(guān)性良好，在一定程度上可滿足醫(yī)院PCT臨床檢測需求。李結(jié)周［18］對新產(chǎn)業(yè)公司化學(xué)發(fā)光試劑盒與瑞萊公司熒光免疫試劑盒進行了比較，結(jié)果表明，瑞萊公司熒光免疫法在便攜性方面勝過化學(xué)發(fā)光法，但準確度與重現(xiàn)性等性能方面不及新產(chǎn)業(yè)化學(xué)發(fā)光法。從比對研究中不難看出，目前市場上PCT 試劑盒的更新迭代主要在于試劑盒的國產(chǎn)化、國產(chǎn)替代進口，優(yōu)化國產(chǎn)試劑性能達到進口試劑的水準；以及檢測方法更新、以性能更優(yōu)異的化學(xué)發(fā)光免疫分析法替代酶聯(lián)免疫、熒光免疫、放射免疫等方法。

基蛋公司檢測儀器及PCT 試劑是通過國家相關(guān)部門批準臨床應(yīng)用的檢測體系，測試結(jié)果整體穩(wěn)定可靠，試劑盒質(zhì)量過關(guān)，故本研究選取該試劑盒比對，結(jié)果顯示該方法與基蛋生物干式免疫法檢測臨床樣本結(jié)果具有良好的相關(guān)性（R2=0.948 7），說明該方法與醫(yī)院原有檢測平臺差異性小。該方法空白限為0.01 ng/ml，回收率為95.65%，線性范圍為0.02～100.00 ng/ml、批內(nèi)精密度均值為5.21%，批間精密度均值為5.57%，與人鈣抑肽、α-CGRP、β-CGRP 基因相關(guān)肽無交叉反應(yīng)，各項性能檢測符合行業(yè)標準要求。

綜上所述，本研究建立的PCT 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析方法兼具小巧、高性能兩方面優(yōu)點，且原料主要為國產(chǎn)，儀器為開放式國產(chǎn)小型化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備，在國家不斷推動體外診斷試劑國產(chǎn)化的大背景下，該方法可供各大試劑廠家借鑒參考。