CRISPR/Cas9系統在傳染病診療中的應用進展①

高 哲 張榮榮 賈天軍

（河北北方學院臨床檢驗診斷學重點實驗室，病原生物學與免疫研究所，張家口 075000）

規律成簇間隔短回文重復序列（clustered regu?larly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/CRISPR 相 關 蛋 白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）系統是一種源自古細菌和細菌的適應性免疫系統。CRISPR/Cas9 系統的快速發展使基因工程領域發生了革命性的變化。作為基因編輯的工具，CRISPR/Cas9系統相對于鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALENs）更加簡單，并具有獨特的切割機制，可靶向多個區域，因此被廣泛采用，成為大多數基因編輯的首選工具。近年來研究發現，CRISPR/Cas9 系統可以作為一種新的治療方法用于某些疾病的預防和治療，如慢性肝炎、寄生蟲感染和人類免疫缺陷病毒（human immune deficiency virus，HIV）感染。本文著重對CRISPR/Cas9 系統在傳染病診療中的最新應用進展進行綜述。

1 CRISPR/Cas9 系統的基本結構及作用機制

84%的古細菌和45%的細菌中均存在CRISPR/Cas 單元，這是一種抵御外來噬菌體和外源DNA 的免疫機制［1］。CRISPR/Cas 系統基因組序列由CRIS?PR 基因座、Cas 基因和tracrRNA 構成。CRISPR 基因座包括前導序列（leader）、間隔序列（spacers）和重復序列（repeats）［2］。前導序列位于重復序列的上游，含有CRISPR 系統的啟動子；間隔序列是一段回文結構，位于重復序列之間，可識別外源DNA；重復序列是一段高度保守序列，其序列的5'端為GTTTG，3'端為GAAAC［3］。Cas 基因位于CRISPR 基因座側旁，編碼對目標DNA 進行特異性切割的Cas蛋白。tracrRNA 具有與CRISPR 短重復序列互補的區域，起連接crRNA 和Cas 蛋白的作用，是CRISPR/Cas9系統成熟并發揮作用的關鍵［4］。

目前應用最廣，研究最深的是CRISPR/Cas9 系統，其結構比其他類型的CRISPR/Cas 系統更加簡單，標志蛋白為Cas9 蛋白［5］。CRISPR/Cas9 系統作用機制大致可分為3個階段：①新間隔序列的獲取：通過對入侵的外源DNA 進行掃描，Cas9識別潛在的原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM），以確定原型間隔序列。然后對外源DNA 進行切割，產生新的間隔序列，儲存到CRISPR/Cas 系統中［6］；②CRISPR 基因座的表達：首先CRISPR 基因座轉錄為前體crRNA（pre-crRNA）和tracrRNA。precrRNA 被加工為成熟的crRNA 后和tracrRNA 形成引導序列sgRNA，將指導Cas9 靶向并切割入侵的DNA［4］；③防御階段：sgRNA 與Cas9 結合，識別靶DNA PAM 位點，并在目標位點引入雙鏈斷裂（DSB）［7］。DSB 可通過非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HR）的方式進行修復，并通過這2 種方式實現特定基因的插入、校正、破壞和缺失。CRISPR/Cas9 系統是迄今為止最簡單、有效和多功能的系統，只需設計sgRNA 即可在任何DNA 靶點生成DSB。對CRISPR/Cas9 系統作用機制的研究，為其體外應用提供了理論依據。因此，這種編輯技術已在科學界迅速普及。

2 CRISPR/Cas9系統在病毒感染中的應用

2.1 在HIV 治療中的應用 通過CRISPR/Cas9 對真核細胞有效的基因編輯，科學家們發現這種方法可用于治療人類病毒感染。研究表明，CRISPR/Cas9 基因編輯是治療HIV 感染的一種新方法。EBINA 等［8］設計了一種針對HIV 基因組中長末端重復序列（LTR）的CRISPR/Cas9系統，并在人類T細胞來源細胞系Jurkat 細胞中進行測試。實驗證明CRISPR/Cas9 系統可以在LTR 區域切割病毒基因組，誘導突變，甚至具有從宿主細胞基因組中消除內部整合HIV 基因的能力。由此表明CRISPR/Cas9系統可以治療HIV 潛伏感染。LIAO 等［9］將Cas9 和gRNA 整合到人多能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）基因組中，生成CRISPR/Cas9-hPSCs。將CRISPR/Cas9-hPSCs 分化為相對均一的細胞群，用HIV 感染這些細胞，研究人員發現這些細胞對HIV 有明顯的抵抗力。實驗結果揭示CRISPR/Cas9系統具有治療HIV感染新策略的潛力。

然而，由于HIV 可逃避CRISPR/Cas9 的編輯，利用CRISPR/Cas9系統治療HIV 仍有限制性。研究發現，通過靶向共同受體也可抑制HIV 感染，其中CCR5 是 最 重 要 的 一 種 受 體。XIAO 等［10］使 用CRISPR/Cas9 和2 個sgRNA 共同編輯CCR5，并通過NHEJ 途徑阻斷CCR5 的表達，增強了CD4+T 細胞對人類免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的抵抗力，為抗HIV-1/AIDS的潛在基因治療方法提供新的途徑。PSIP1 基因編碼的LEDGF/p75 是整合酶的輔助因子，是HIV 基因整合到宿主細胞染色體所必須的。LAMPI 等［11］使用CRISPR/Cas9對PSIP1位點進行頂點編輯，將第366位的天冬氨酸殘基轉化為天冬酰胺（D366N），中斷了LEDGF/p75 與HIV 整合酶的相互作用，但不會影響LEDGF/p75 在細胞內的功能。研究人員發現，D336N 細胞中HIV 復制減弱，表明靶向LEDGF/p75有助于HIV的治療。

miRNAs 在各種疾病中的功能是近年來研究的熱點問題。miR146 是一種與HIV 感染相關的mi-RNA。研究發現，miR-146a可減少CD4+T細胞計數，并降低抗病毒細胞因子的產生和活化的CD8+T細胞的細胞毒作用［12］。TENG 等［13］通過CRISPR/Cas9 系統敲除miR-146a，破壞miR-146a 細胞因子通路，增加細胞因子和干擾素刺激基因的表達，從而加強對HIV 感染的抗病毒反應。因此，使用CRISPR/Cas9系統靶向miRNAs 有助于HIV 的治療。最近研究發現，通過CRISPR/Cas9 系統激活內源性的抗病毒化合物Tetherin 基因，增加其表達可抑制HIV 復制［14］。另一方面，科學家目前已經可以使用CRISPR/Cas9系統體外編輯人的B 細胞，使其表達抗HIV-1 廣譜中和抗體，并保留其參與體液免疫的能力，用于HIV的治療［15］。總之，CRISPR/Cas9 是治療HIV 的新方法，但目前仍存在一定的局限性，需要進一步的研究。

2.2 在肝炎治療中的應用 肝炎病毒感染是引起肝炎的主要原因，其中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是最危險且最常見的。HBV是一種DNA病毒，通過與鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白結合入侵肝細胞［16］。HBV基因組進入細胞核后，由松弛的環狀DNA轉化為共價閉合環狀DNA（cccDNA），并整合到肝細胞基因組中。機體HBV 免疫應答是造成肝損傷的主要原因，特別是細胞毒性T 細胞（cytotoxic T cell，CTL）可清除HBV 感染的肝細胞，直接造成肝損傷［17］。如果治療不及時，慢性乙型肝炎可轉化為肝硬化。目前臨床治療HBV 感染的方法主要是逆轉錄酶（reverse transcriptase，RT）抑制劑和基于IFN-α的免疫調節劑。然而，這些藥物均存在一個缺點，那就是它們不能根除cccDNA，停藥后HBV 復制反彈。目前，研究人員正在探尋效果更好、更徹底的方法，其中通過CRISPR/Cas9 系統治療HBV 感染取得了一定的進展。

CRISPR/Cas9治療HBV感染的主要趨向是降低肝內HBV cccDNA 表達，從而抑制HBV 的慢性感染。RAMANAN 等［18］使用CRISPR/Cas9 系統靶向和切割HBV 基因組保守區域，顯著降低HBV cccDNA 表達水平，證明了Cas9 進行cccDNA 定向抗病毒治療的潛力。最近，KOSTYUSHEV 等［19］的實驗結果顯示CRISPR/Cas9 可導致cccDNA 降解和移碼突變，從而顯著降低cccDNA 產生病毒RNA 的能力。與腦膜炎奈瑟菌（neisseria meningitidis，Nm）和弗朗西斯氏菌（francisella novicida，Fn）相比，來自化膿鏈球菌（streptococcus pyogenes，Sp）和嗜熱鏈球菌（strepto?coccus thermophilus，St）的CRISPR/Cas9系統有效靶向HBV cccDNA 降解和抑制HBV 復制，在轉染后6 d 內導致90%以上的HBV cccDNA 降解，抗HBV活性更高，并且更加安全。然而Sp CRISPR/Cas9 與腺相關病毒（adenovirus associated，AAV）載體不兼容，存在運輸困難的問題。為了解決這一問題，研究人員在金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，Sa）中鑒定出更小的Cas9蛋白，以AAV為載體運輸。并且研究發現，Sa CRISPR/Cas9 系統可以準確有效地靶向HBV 基因組并抑制HBV 的復制，可以作為治療慢性HBV 感染的一種新策略［20］。另一方面，WANG 等［21］構 建 了 一 種HBV 特 異 性gRNA-miRHBV-gRNA 三元盒以探究miR-31 對CRISPR/Cas9在消除HBV cccDNA 中的作用。實驗結果顯示miR-31 與2 種HBV 特 異 性gRNA 在 抑 制HBV 復 制方面具有協同作用，可增強CRISPR/Cas9 清除HBV cccDNA 和抑制HBV 復制的能力。對于修復通路在CRISPR/Cas9抗HBV活性中作用的研究在近期也取得了一定進展。KOSTYUSHEV 等［22］使用NHEJ 的強抑制劑NU7026，發現抑制NHEJ 會削弱CRISPR/Cas9 對HBV cccDNA 的降解，從而說明了NHEJ 對于CRISPR/Cas9 抗HBV 的重要性，并且也進一步證明了CRISPR/Cas9 對于降解cccDNA 的高效性。以上實驗均表明CRISPR/Cas9系統有望用于臨床治療人體HBV感染。

CRISPR/Cas9系統的DNA靶向性已經被廣泛研究。然而，HCV 是一種RNA 病毒，CRISPR/Cas9 系統靶向RNA 的潛在治療作用需要進一步驗證。研究人員在Fn 中鑒定出一種既能靶向DNA 又能靶向RNA 的CRISPR/Cas9 系統。該CRISPR/Cas 基因座中包含1 個獨特的小RNA，稱為CRISPR/Cas 相關小RNA（scaRNA）［23］。scaRNA 的功能與crRNA 幾乎相同：它與tracrRNA 相互作用，與Fn Cas9 形成靶向復合物。PRICE 等［24］開發了針對HCV 基因組的RNA靶向引導RNA（rgRNA）。rgRNA 具有與sgRNA 相似的設計，包含與單鏈scaRNA 結合的tracrRNA 序列。通過產生與HCV 基因組互補的scaRNAs 序列，Fn Cas9 可以與HCV RNA 特異性地相互作用。并且通過實驗表明Fn Cas9系統可以靶向并抑制HCV 基因的復制和表達，證明了CRISPR/Cas9 系統治療HCV感染的可行性。近年來，研究者在此方面進行了大量的研究。

長鏈非編碼RNA（long noncoding ，lncRNAs）在許多細胞生理過程中起著重要的調控作用。其中lncRNA-IFI6 是1 種新的lncRNA，獨立于JAK-STAT途徑調節HCV 感染，可負調控干擾素誘導蛋白6（interferon-induced protein 6，ITIF6）啟動子，從而增加HCV 復 制。LIU 等［25］研究表明CRISPR/Cas9 對lncRNA-IFI6 基因的突變誘導和破壞可抑制HCV 感染。另一方面，DUAN 等［26］使用CRISPR/Cas9-gRNA或siRNA 過度表達或敲除miR-130a 和其靶基因自噬相關基因5（autophagy-related gene 5，ATG5），發現ATG5顯著上調HCV復制并下調ISGs表達。由此證明了miR-130a 通過ATG5 依賴性自噬途徑靶向ATG5以調節宿主抗病毒反應和HCV 復制。雖然目前對CRISPR/Cas9 系統治療HCV 感染的研究取得一定進展，但就目前的研究成果來看，將CRISPR/Cas9 系統廣泛應用于臨床治療上仍需要很長的一段時間。

2.3 在新型冠狀病毒研究中的應用 冠狀病毒是引起人類呼吸系統和神經系統疾病的常見病因。2019 年世界爆發了由未知病毒引起的肺炎疫情，通過對患者分泌物的檢測確定這是1種先前未知的冠狀病毒，世界衛生組織將其命名為“COVID-19”。準確、快速的診斷工具對于控制疫情至關重要。研究發現，CRISPR/Cas 系統在COVID-19 肺炎診斷中有很大潛力，尤其是CRISPR/Cas13系統具有很好的診斷效果［27］。由于目前缺少抗病毒藥物和疫苗，因此迫切需要動物模型。SUN 等［28］利用CRISPR/Cas9 敲入技術建立了一個表達人血管緊張素轉換酶Ⅱ（human angiotensin converting enzyme，hACE2）的小鼠模型，探究嚴重急性呼吸道綜合征2 型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的傳播和發病機制。小鼠模型中hACE2 的組織分布與COVID-19 患者的臨床發現相吻合，在肺中檢測到高水平的hACE2 表達。并且發現老年hACE2 小鼠的病理變化更接近COVID-19 患者。因此，該模型有望成為評價COVID-19 疫苗和治療方法的工具。

3 CRISPR/Cas9系統在寄生蟲感染中的應用

CRISPR/Cas9 系統不但可以治療病毒感染，在治療寄生蟲感染方面也具有潛在的療效。在克氏錐蟲線粒體鈣離子攝入蛋白1（MICU1）和MICU2 對其致病性影響的研究中，研究人員使用CRISPR/Cas9 技術敲除這2 個基因，觀察到敲除MICU1 和MICU2 的克氏錐蟲的生長速度減緩并且侵襲能力降低［29］。其結果揭示了這2種基因似乎在克氏錐蟲致病性中起著關鍵作用，利用CRISPR/Cas9 技術對其進行靶向治療，有望成為治療錐蟲病的新途徑。

惡性瘧原蟲是一種引起瘧疾的寄生蟲。惡性瘧原蟲的線粒體核糖體對維持線粒體膜電位和寄生蟲生存能力至關重要。LING 等［30］利用CRISPR/Cas9 技術敲除了PfmtRPS12 和PfmtRPS18 基因，發現惡性瘧原蟲出現生長衰竭，從而表明對惡性瘧原蟲線粒體核糖體的破壞抑制了線粒體的代謝能力，使寄生蟲對靶向線粒體功能的抑制劑過敏。惡性瘧原蟲線粒體電子傳遞鏈中的一些蛋白質是由線粒體中的線粒體核糖體翻譯的。在另一項研究中，研究人員設計了能夠靶向編碼惡性瘧原蟲線粒體核糖體蛋白L13（RPL13）基因的CRISPR/Cas9 系統。實驗結果證明CRISPR/Cas9 敲除PfmRPL13 可導致瘧原蟲線粒體膜電位喪失、生長停滯和死亡［31］。此外，研究表明，利用CRISPR/Cas9阻斷惡性瘧原蟲中棒狀體蛋白RON3 基因的表達，可降低紅細胞對葡萄糖的攝取，并損害瘧原蟲的生命周期［32］。

研究人員還探討了CRISPR/Cas9治療弓形蟲病的療效。在最近的研究中，MA 等［33］利用CRISPR/Cas9 技術敲除弓形蟲wx2 基因，結果表明wx2 基因的缺失明顯抑制了宿主細胞體外寄生蟲的生長和復制，降低了小鼠體內寄生蟲的毒力。在另一項研究中，研究人員運用CRISPR/Cas9 技術敲除弓形蟲免疫作圖蛋白1（toxoplasma gondii immune mapping protein 1，TgIMP1）基因，結果顯示基因敲除株的增殖明顯降低，毒力減弱［34］。總之，CRISPR/Cas9 可能是一種更有效治療寄生蟲感染的新方法，但其在寄生蟲體內運輸困難仍是目前需要解決的問題之一，希望未來能找到解決這一問題的有效方法，使其更好的應用于臨床治療。

4 總結與展望

CRISPR/Cas9 技術具有高度的DNA 特異性、較高的選擇性和較低的副產物水平，其快速發展推動了基因編輯應用的迅速擴展，并對藥物和生物技術研究產生了重大影響。目前，CRISPR/Cas9 技術在治療各種細菌、病毒和寄生蟲感染性疾病方面的應用受到廣泛討論。這項技術可以用來破壞病毒和寄生蟲等傳染源的基因組，或者破壞與病毒和非病毒感染的發病機制有關的宿主細胞基因，從而治療感染。而且通過與其他技術相結合，CRISPR/Cas9還可用于疫苗的研制。

然而CRISPR/Cas9基因編輯技術目前仍存在缺陷。其中，最關鍵的缺陷是其潛在的脫靶效應。研究人員目前已開發出許多方法來減少脫靶效應，如偏靶或無偏靶檢測、堿基編輯、gRNA 修飾和抗CRISPR（Acr）蛋白等［35］。但在臨床廣泛應用該技術治療疾病之前，還需要提高其效率、特異性和實用性。CRISPR/Cas9 系統在臨床治療方面有著巨大的潛力，未來必將改變治療疾病的方式，為人類健康保駕護航。