2型糖尿病患者內皮細胞基因差異表達與信號通路

徐魁 李敏才

(湖北科技學院 1臨床醫學院，湖北 咸寧 437100；2基礎醫學院)

糖尿病(DM)，特別是2型糖尿病(T2DM)是嚴重的代謝性疾病，高血糖將引起血管受損、動脈硬化和周圍血管病變。DM患者由于高血糖引起的內皮細胞功能障礙是常見的病理現象，內皮細胞功能障礙導致視網膜微血管功能受損和腎小球濾過屏障的通透性下降，構成DM視網膜病變和DM腎病等并發癥病變基礎。本研究從DM患者和正常對照個體中分離真皮組織中內皮細胞，對其RNA測序(RNA-seq)進行比較差異表達的基因。

生物學研究的新領域——大數據基因表達芯片技術的出現，通過比較基因表達譜變化，篩選出與疾病相關的基因〔1〕。還可以對差異性基因參與的生物學過程、通路分析研究〔2〕。為研究T2DM患者與健康者內皮細胞的基因表達譜的差異性，以GSE92724芯片數據為樣本〔3〕，運用基因富集分析(GSEA)軟件，采用生物信息學方法對基因本體(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路和蛋白質相互網絡(STRING)分析可能存在的分子機制、探索相關生物學通路和風險預測，為T2DM內皮細胞功能障礙治療靶點奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1樣本數據來源 在Pubmed的GEO數據庫中輸入“type 2 diabetic patients”，選擇GSE92724的芯片數據作為研究對象。該芯片數據樣本來自4例T2DM患者、6例健康對照者外科手術切除的真皮組織，采用流式細胞儀(FACS)檢測內皮細胞表面標志物(CD31+，CD45-，Podoplanin-)分離得到內皮細胞樣本。

1.2數據分析 下載GSE92724的CEL文件，對探針水平的信號值進行數據歸一化和基因注釋處理，最終轉化為基因表達水平的中位值〔2，4〕。

1.3差異性基因分析 對4例T2DM患者、6例對照者基因表達值，通過在線工具BioJupies軟件分析差異性基因，繼而對差異性基因進行火山圖表示。通過倍比法(FC)和假發現率(FDR)篩選顯著差異性基因分析，篩選條件：FDR<0.05，P≤0.01且|logFC|>1.5。對顯著性差異化基因進行聚類熱圖分析〔5〕。

1.4GSEA 對處理后的GSE92724數據表達值，采用GSEA軟件進行GO功能富集的生物學過程和KEGG的通路富集分析〔6〕，分析次數設置為1 000，并按分析的富集分數(ES)進行標準化(NES)值排序。

1.5蛋白質網路分析及核心基因分析 對GSEA分析得到的顯著性差異基因(閾值為>0.4)進行STRING分析(https：/string-db-org.com)，將分析得到的數據導入Cytoscape得到蛋白質表達網絡圖，并進行核心基因表達分析〔7〕。

1.6統計學方法 本實驗結果均采用相關軟件檢驗標準，檢驗水準：α=0.05，P<0.05有統計學意義。在線R軟件BioJupies分析差異表達基因，采用倍數變化和顯著性分析，設置P≤0.05 且|logFC|>1.5。GSEA軟件GO功能富集分析和KEGG通路富集分析采用軟件推薦P<0.01。PPI軟件和Cytoscape軟件分析采用推薦P<0.05。

2 結 果

2.1基因芯片數據差異性分析 通過對探針水平的信號值進行質控、變異穩定性分析、背景校正、數據歸一化處理，對基因表達譜中位值進行差異基因分析，發現T2DM患者與健康對照者內皮細胞的差異表達基因1 633個(P<0.05)，進一步篩選出極其顯著性差異表達基因，篩選條件：P<0.05并且|log2FC|>1.5，共篩選出777個，其中表達上調基因126個，表達下調基因651個。按Pearson系數進行聚類繪制成熱圖，前75個基因的表達結果見圖1。

圖1 前75個顯著性差異表達基因的聚類熱圖

2.2GO功能富集分析 GO富集分析包括生物學過程(BP)，分子功能(MF)和細胞成分(CC)，選取BP分析，功能分析顯示T2DM中上調基因參與多個生物學過程，排在前5位生物學過程分別為呼吸爆發的正性調節(GO：0060267)、免疫效應過程調節(GO：0002697)、體液免疫反應調節(GO：0002920)、蛋白質激活級聯調節(GO:0000257)、蛋白質加工調節(GO:0070613)；T2DM下調基因參多個生物學過程，排在前5位生物學過程：表皮發育(GO:008544)、乳腺上皮發育(GO:0061180)、乳腺發育(GO:0030879)、建立皮膚屏障(GO:0061436)、皮膚發育(GO:0043588)。

2.3KEGG通路富集分析 KEGG通路分析顯示T2DM上調基因參與多個通路調節，排在前5位通路調節：類風濕關節炎(hsa05323)、瘧疾(hsa05144)、自身免疫性甲狀腺疾病(hsa05320)、造血細胞譜系(hsa04640)、金黃色葡萄球菌感染(hsa05150)；T2DM下調基因參與多個通路調節，排在前5位通路調節：黑色素(hsa04916)、癌癥中的蛋白多糖(hsa05205)、基底細胞癌(hsa05217)、干細胞多能性信號通路(hsa04550)、細胞因子-受體相互作用(hsa04060)。

2.4蛋白質相互作用和核心基因分析 彩色標記的核心基因位于樞紐位置見圖2。

圖2 顯著性差異基因的蛋白質網絡

以P值≤0.01 且|logFC|>2為條件得到659個極其顯著性差異表達基因輸入在線STRING軟件，分析結果顯示節點值622，邊緣值2 084，預期邊緣值914，PPI富集呈顯著差異，主要體現在組織發育、上皮發育、系統發育等生物學過程，分子功能表現為Ca離子結合、DNA結合轉錄激活因子活性、Frizzled連接、信號受體結合等。將分析得到的蛋白質之間的相互作用得分值輸入Cytoscape，得到蛋白質相互作用網絡圖。在評分>300條件下進行核心基因篩選，得到CCL20、LPAR3、LPAR1、LPAR5、NMU、PTGER3、S1PR5、CCL27、ACKR3等核心基因。

3 討 論

內皮細胞作為血管壁的屏障，調節血流量和血管張力，維持血管穩態。內皮細胞功能障礙〔8〕是指血管舒張因子(一氧化氮、前列環素、內皮衍生超極化因子等)和血管收縮因子(內皮素、血管緊張素Ⅱ、血栓烷等)的平衡失調，導致血管收縮功能增強。內皮功能障礙是多種血管疾病的早期階段，如心血管內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素，氧化的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)接觸損傷的內皮并積聚在內皮下，逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊〔9〕。內皮功能障礙是DM最有害的事件之一〔10〕。DM循環中的高葡萄糖引發內皮功能障礙和細胞凋亡，會加速動脈粥樣硬化血管疾病，形成的繼發性病變如DM腎病、DM視網膜病變、DM足。因而DM內皮細胞功能失調，被認為是血管病變的首發因素。基因芯片的大數據測試能發現基因表達譜改變，為揭示疾病的分子機制提供幫助。在DM真皮血管內皮細胞與健康對照組的差異性基因中，進行GO富集分析得到上調的生物學過程：呼吸爆發的正性調節〔11〕，免疫效應過程調節〔12〕、體液免疫反應調節〔13，14〕等。氧化應激是導致其內皮功能障礙的最重要機制之一，通常丙二醛(MDA)反映機體氧化應激水平，而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽(GSH)可反映機體的抗氧化應激水平。因而DM患者生物學過程表現出呼吸爆發的正性調節〔11〕。在DM真皮血管內皮細胞的富集差異基因GO分析中，與對照組相比，一些下調的生物學過程：如GO功能富集的表皮發育、乳腺上皮發育、乳腺發育，符合DM患者表皮生長發育遲緩、皮膚中腺上皮發現緩慢，與相關的文獻報道研究相一致〔15〕。研究發現類風濕關節炎與DM存在明顯的相關性〔16〕，DM作為瘧疾的危險因素存在〔17〕。同樣在大數據分析中，自身免疫性甲狀腺疾病、類風濕關節炎與DM之間存在明顯的富集相關性〔18〕。

KEGG通路富集研究中，發現黑色素、癌癥中的蛋白多糖、基底細胞癌等通路下調。DM皮膚病變中，存在與正常組織不一樣的調節方式〔19〕。血漿中的蛋白多糖完全可成為DM的評價指標〔20〕。大數據分析顯示14個新等位基因與基底細胞癌發生有關，提示DM發生基底細胞癌的概率減少，以往報道DM患者皮膚腫瘤性疾病較少相一致〔20〕。

將GSE92724芯片數據中差異表達基因譜導入，通過STRING分析結果值導入Cytoscape分析：主要有核心基因趨化因子(CCL)20、CCL27〔21〕、溶血磷脂受體(LPAR)1、LPAR3〔22〕、神經介質(NM)U〔23〕、前列腺素E2受體EP3亞型(PIGER3)、鞘氨醇1-磷酸受體(S1PR)5〔24〕、非典型趨化因子受體(ACKR)3〔25〕。以往研究發現，DM患者中趨化因子〔21〕及受體〔25〕表達上調，介導DM中炎癥病變，核心基因PIGER3也證實這一過程〔26，27〕。在部分DM患者中，表現溶血磷脂受體〔22〕和鞘氨醇-磷酸受體上調〔24〕，與脂質代謝、炎癥病變相關。