利伐沙班聯(lián)合Gsα基因沉默對(duì)心力衰竭大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

魏長民 劉福珍 崔玉強(qiáng)

(勝利油田中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 東營 257000)

心力衰竭的發(fā)生與心肌炎癥、凋亡等密切相關(guān)〔1〕。利伐沙班對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用〔2〕。利伐沙班對(duì)心力衰竭有治療作用，治療后患者心臟功能明顯改善〔3〕。Gsα蛋白α亞單位(Gsα)蛋白可調(diào)控心功能〔4〕。干擾Gsα的心力衰竭幼鼠心功能指數(shù)改善，低表達(dá)Gsα可能具有改善心力衰竭的作用〔5〕。本研究擬分析利伐沙班聯(lián)合Gsα基因沉默對(duì)心力衰竭大鼠心肌損傷的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠，SPF級(jí)，7周齡，體重220～260 g，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為：SYXK(魯) 20190007。藥品與試劑：兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體由美國Abcam公司生產(chǎn)；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司生產(chǎn)；兔抗Bcl-2抗體由美國Santa Cruz Biotechnology公司生產(chǎn)；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒由上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)；兔抗Toll樣受體(TLR)4抗體由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；利伐沙班片，國藥準(zhǔn)字H20213305，規(guī)格：10 mg，批號(hào)：0021501由北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司生產(chǎn)；兔抗核因子(NF)-κB p65抗體由碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；白細(xì)胞介素(IL)-6檢測(cè)試劑盒由上海傳秋生物科技有限公司生產(chǎn)；shRNA control、Gsα shRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。儀器MP160生理記錄儀為美國 BIOPAC產(chǎn)品；XSP-3C顯微鏡為上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀為美谷分子儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2模型構(gòu)建〔6〕腹主動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建心力衰竭模型，大鼠經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后，在手術(shù)前12 h禁止采食，10%水合氯醛麻醉，從劍突下1 cm處切口，用擴(kuò)胸器撐開切口，取出盲腸，用無菌紗布將盲腸覆蓋，分離腹主動(dòng)脈，穿4號(hào)手術(shù)線，將7號(hào)針頭在腹主動(dòng)脈并行，結(jié)扎腹主動(dòng)脈和7號(hào)針頭，緩慢抽出針頭，關(guān)閉腹腔并縫合切口。注射青霉素防止感染。大鼠手術(shù)后8 w，隨機(jī)選擇4只大鼠，檢測(cè)左室舒張末期壓(LVEDP)大于15 mmHg表示造模成功。另外選擇12只大鼠，不結(jié)扎，其余同造模操作，記為對(duì)照組。

1.3分組給藥 60只造模成功的大鼠分成模型組、sh-NC組、利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組、利伐沙班+sh-Gsα組，每組12只。造模成功后，sh-NC組、利伐沙班+sh-NC組在心包腔內(nèi)注射100 μg shRNA control〔溶解在300 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi)〕，sh-Gsα組、利伐沙班+sh-Gsα組在心包腔內(nèi)注射100 μg Gsα shRNA (溶解在300 μl的PBS內(nèi))〔5〕。對(duì)照組、模型組注射等量的PBS。同時(shí)利伐沙班+sh-NC組、利伐沙班+sh-Gsα組灌胃20 mg/kg利伐沙班〔7〕。連續(xù)治療4 w。最后1次給藥后12 h，首先檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)，然后分離大鼠心肌組織，分別用于Western印跡、TUNEL、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。

1.4Western印跡〔8〕檢測(cè)Gsα、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá) 取0.1 g心肌組織，添加含有PMSF的裂解溶液，在冰上充分裂解，提取組織蛋白。在蛋白中添加2倍上樣緩沖液，混合，在100℃煮沸5 min。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。每個(gè)孔中上樣30 μl蛋白樣品，首先以90 V電壓電泳至濃縮膠與分離膠的交界處時(shí)，以110 V電壓繼續(xù)電泳。以100 V電壓轉(zhuǎn)膜60 min。用5%脫脂奶粉封閉。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在一抗內(nèi)(除了NF-κB p65抗體以1∶1 000稀釋，其余抗體均以1∶1 200稀釋)，于4℃過夜。PVDF膜放在二抗(以1∶2 000稀釋)內(nèi)，在室溫結(jié)合60 min。ECL發(fā)光，根據(jù)灰度值，β-actin作為參照，分析目的蛋白表達(dá)量。

1.5血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)〔9〕腹腔注射戊巴比妥鈉，分離頸總動(dòng)脈，將遠(yuǎn)心端結(jié)扎，在近心端切口，導(dǎo)管一端連接壓力傳感器，一端插入左心室，用生理信號(hào)采集系統(tǒng)檢測(cè)LVEDP、左室收縮壓期末壓(LVESP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.6TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡〔10〕心肌組織常規(guī)方法固定，石蠟切片。二甲苯浸泡2次，在100%、95%、90%、80%、70%乙醇中浸泡5 min。PBS洗滌。將切片放在蛋白酶K工作液中，37℃孵育15 min。置于封閉液內(nèi)，室溫封閉10 min。滴加TdT酶反應(yīng)液，37℃避光反應(yīng)60 min。滴加POD溶液，37℃避光反應(yīng)60 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。二甲苯?jīng)_洗，封片。在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，TUNEL陽性所占全部細(xì)胞百分比為細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.7ELISA試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、IL-6水平〔10〕取心肌組織，添加冰預(yù)冷的生理鹽水，勻漿。以ELISA試驗(yàn)檢測(cè)心肌組織中TNF-α、IL-6含量，步驟根據(jù)TNF-α檢測(cè)試劑盒、IL-6檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌組織中Gsα蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、模型組、sh-NC組、sh-Gsα組心肌組織中Gsα蛋白表達(dá)量分別為0.27±0.03、0.59±0.05、0.60±0.04、0.33±0.02，模型組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；sh-Gsα組蛋白表達(dá)量與sh-NC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組心肌組織中Gsα蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

2.2利伐沙班聯(lián)合Gsα基因沉默對(duì)心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響 模型組LVEDP、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組與sh-NC組上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα組與利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.3利伐沙班聯(lián)合Gsα基因沉默對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bax、Bcl-2表達(dá)量與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組與sh-NC組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα組與利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表2。

1～6：對(duì)照組，模型組，sh-NC組，利伐沙班+sh-NC組，sh-Gsα組，利伐沙班+sh-Gsα組；同圖3圖2 各組心肌組織中凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)量比較

2.4利伐沙班聯(lián)合Gsα基因沉默對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織炎癥因子TNF-α、IL-6的影響 對(duì)照組、模型組、sh-NC組、利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組、利伐沙班+sh-Gsα組心肌組織中TNF-α含量分別為(362.51±21.42)ng/L、(971.9±50.48)ng/L、(993.11±65.37)ng/L、(691.68±49.33)ng/L、(716.78±76.87)ng/L、(471.87±34.51)ng/L，IL-6含量分別為(87.52±7.88)ng/L、(290.49±23.15)ng/L、(281.04±24.54)ng/L、(198.38±9.52)ng/L、(184.74±16.98)ng/L、(122.48±10.04)ng/L，模型組TNF-α、IL-6含量與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組與sh-NC組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα組與利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5利伐沙班聯(lián)合Gsα基因沉默對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組、模型組、sh-NC組、利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組、利伐沙班+sh-Gsα組心肌組織中TLR4蛋白表達(dá)量分別為0.25±0.02、0.75±0.08、0.74±0.07、0.58±0.06、0.53±0.08、0.34±0.04，NF-κB p65蛋白表達(dá)量分別為0.28±0.05、0.71±0.09、0.65±0.09、0.44±0.03、0.47±0.05、0.38±0.03，模型組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組與sh-NC組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利伐沙班+sh-Gsα組與利伐沙班+sh-NC組、sh-Gsα組比較上述指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組心肌組織中凋亡蛋白TLR4、NF-κB p65表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

心力衰竭的發(fā)生與心肌細(xì)胞凋亡、心肌炎癥等密切相關(guān)〔9,11〕。參與細(xì)胞凋亡的蛋白有多種，其中較為典型的是Bcl-2蛋白家族，Bax和Bcl-2分別為Bcl-2蛋白家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，二者表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔12〕。TNF-α、IL-6均為炎癥因子，可誘導(dǎo)炎癥發(fā)生〔13〕。TNF-α、IL-6在心力衰竭過程中過度表達(dá)，且TNF-α、IL-6等炎癥因子還可以進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加快心肌損傷〔14〕。利伐沙班是抗凝血藥，對(duì)心力衰竭有改善作用，利伐沙班可延緩心力衰竭進(jìn)程〔2,15〕。Gsα可調(diào)控心臟β受體，干擾Gsα對(duì)心力衰竭幼鼠心功能有明顯的改善作用〔5〕。本研究結(jié)果提示利伐沙班聯(lián)合沉默Gsα可保護(hù)心力衰竭心肌損傷。

TLR4是Toll樣受體家族，可激活NF-κB信號(hào)，誘導(dǎo)下游炎癥因子活化，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡〔16〕。NF-κB p65是NF-κB信號(hào)的關(guān)鍵亞單位，其表達(dá)增多，NF-κB信號(hào)激活水平增加〔17〕。TLR4/NF-κB在心力衰竭中過度激活，抑制其激活可減輕心力衰竭心肌損傷〔18〕。本研究結(jié)果說明，利伐沙班聯(lián)合沉默Gsα降低心肌組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量，利伐沙班聯(lián)合沉默Gsα可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)減少心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，這為心力衰竭的治療提供了思路，為研究利伐沙班、沉默Gsα對(duì)心力衰竭分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。