STAT3抑制劑及煙酰胺聯合用藥對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用及機制研究

詹雯靜，梁銘杰，劉媛，黃遠鳳，王瑋璇

肝癌是我國最嚴重的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均位居前列［1］。作為機體內調控細胞增殖、凋亡、上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和糖代謝等多種生物過程的重要轉錄因子，信號傳導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在包括肝癌在內的多種惡性腫瘤中被過度激活［2］。因此，對STAT3 的活性進行抑制是一種有效的潛在抗癌策略。Stattic和S3I-201是2種常用的STAT3抑制劑，通過干擾STAT3 的二聚化，使其不能進入細胞核，從而抑制STAT3的轉錄調控活性［3］。然而，在實際應用中需要高濃度的藥物才能較好地抑制STAT3活性，但這會對正常細胞產生損傷。目前尚無獲準應用于臨床的直接靶向STAT3 的藥物［4］。煙酰胺（nicotinamide，Nam）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的前體。作為細胞生命活動的重要分子，NAD 參與了包括糖酵解、三羧酸循環和β-氧化等在內的重要生物過程［5］。補充NAD 前體Nam 具有包括防治癌癥在內的多種有益作用［6］且可以下調肺癌細胞中STAT3 Y705 位的磷酸化水平［7］。但Nam 及其與STAT3 抑制劑聯合用藥對肝癌的影響及機制仍不明確。本研究以肝癌細胞HepG2為模型，從細胞凋亡、EMT及糖酵解角度探討STAT3 抑制劑、Nam 以及兩者聯合用藥對肝癌細胞增殖的影響及其機制，以期為肝癌臨床治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。STAT3 抑制劑S3I-201 和Stattic 購自Selleck 公司；Nam購自Sigma-Aldrich 公司；青/鏈霉素購自維森特生物技術（南京）有限公司；胎牛血清、DMEM 高糖培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Thermo Fisher Scientific 公司；PVDF 膜購自Millipore 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG以及p-STAT3兔單克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司；STAT3 鼠單克隆抗體購自ProteinTech 公司；ECL 發光液購自Bio-Rad 公司；RNAiso-Plus 試劑、逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自Takara公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA細胞裂解液、二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶抑制劑cocktail 和磷酸酶抑制劑購自Selleck 公司。Centrifuge 5810R 離心機購自Eppendorf 公司；NanoDrop 2000 核酸濃度測定儀購自Thermo Fisher Scientific 公司；Eon微孔板分光光度計購自BioTek 公司；LightCycler 480 熒光定量PCR 儀購自Roche 公司；電泳儀、轉膜儀及凝膠成像系統購自Bio-Rad公司。

1.2 Western blot檢測STAT3和p-STAT3蛋白的表達 HepG2用含有1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養。將對數生長期的HepG2細胞接種于6 孔板中，過夜培養，待細胞貼壁后，根據文獻中使用的藥物濃度，設置對照組（Ctrl）、單用藥組（100μmol/L S3I-201［8］、1.5μmol/L Stattic［9］和5 mmol/L Nam［7］）與聯合用藥組（100 μmol/L S3I-201+5 mmol/L Nam 組和1.5 μmol/L Stattic+5 mmol/L Nam組）。藥物處理24 h后，吸去細胞培養基，用預冷的PBS洗滌細胞2次，收集細胞后加入適量的RIPA裂解液（添加1%蛋白酶抑制劑cocktail和1%磷酸酶抑制劑），冰上靜置30 min裂解細胞。在4 ℃，12 000 r/min離心20 min 后收集上清液。用BCA 蛋白檢測試劑盒測定濃度后，用12%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后將蛋白轉移到PVDF 膜上。使用5%的脫脂牛奶進行封閉，一抗STAT3（稀釋比例1∶1 000）、p-STAT3（稀釋比例1∶1 000）和β-actin（稀釋比例1∶3 000）4 ℃孵育過夜，HRP 標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（稀釋比例1∶2 000）室溫孵育1.5 h后，將ECL化學發光顯影液均勻地滴在PVDF 膜上，在全自動凝膠成像儀中進行顯影，結果使用Image Lab軟件進行分析。

1.3 RNA的提取和qPCR 將對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板中，過夜培養，待細胞貼壁后，按照1.2所述設置對照組（Ctrl）、單用藥組與聯合用藥組，處理24 h后收集細胞提取RNA并進行逆轉錄。RNA的提取以及qPCR過程根據Takara公司的說明書進行。具體反應體系如下：TB Green Premix Ex TaqⅡ（2×）5 μL，cDNA（1 g/L）2 μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.6μL，ddH2O 1.8μL。反應條件如下：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環。采用2-ΔΔCt法對基因相對表達水平進行定量分析。引物由北京睿博興科生物技術公司合成，見表1。

1.4 細胞增殖實驗 將對數生長期的HepG2細胞接種于6孔培養板中，過夜培養，待細胞貼壁后，按照1.2 所述設置對照組（Ctrl）、單用藥組與聯合用藥組，處理36 h 后，細胞長至80%～90%時，收集細胞，用0.4%的臺盼藍試劑染色，用細胞計數板進行細胞計數。

1.5 統計學方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析與做圖，數據采用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STAT3 抑制劑及Nam 對STAT3 Y705 磷酸化水平的影響 S3I-201、Stattic 及Nam 均可顯著降低HepG2細胞STAT3 Y705 的磷酸化水平，且聯合用藥（Nam+S3I-201 和Nam+Stattic）比單用藥對STAT3 Y705磷酸化抑制效果更強，見圖1。

2.2 STAT3 抑制劑及Nam 對STAT3 下游靶基因的影響 相比Ctrl組，S3I-201、Stattic及Nam單用藥與聯合用藥組STAT3 下游靶基因SNAIL1、VEGFA和ZEB1的mRNA 表達水平顯著降低；與S3I-201 單藥相 比，Nam 和S3I-201 聯 合 用 藥 組 中SNAIL1和VEGFAmRNA 表達水平顯著降低；與Stattic 單藥相比，Nam 和Stattic 聯 合 用 藥 組 中VEGFA和ZEB1mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

Fig.2 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of STAT3 downstream target genes圖2 STAT3抑制劑及Nam對STAT3下游靶基因mRNA表達水平的影響

2.3 STAT3 抑制劑及Nam 對細胞增殖的影響 相比于Ctrl 組，Nam 單獨用藥與聯合用藥可以顯著抑制細胞增殖，并且Nam 與Stattic 聯合用藥對于細胞增殖的抑制效果比Stattic單獨用藥更明顯，見圖3。

2.4 STAT3 抑制劑及Nam 對細胞增殖相關基因表達的影響 相比Ctrl 組，單用藥組和聯合用藥組MCM7和MYCmRNA 表達水平顯著降低，且聯合用藥組中MCM7的表達水平均低于單用藥組；相比Ctrl組，除S3I-201 及Stattic 處理組，其余各組MKI67mRNA表達水平顯著降低。見圖4。

2.5 STAT3 抑制劑及Nam 對細胞凋亡相關基因表達的影響 相比Ctrl 組，單用藥組和聯合用藥組中促凋亡基因BAXmRNA 表達量顯著升高，抗凋亡基因BCL-2和MCL-1mRNA 表達量顯著降低。且Nam 和Stattic 聯合用藥組中BAXmRNA 表達水平顯著高于單用藥組，Nam 和S3I-201 聯合用藥組中BCL-2mRNA表達水平顯著低于單用藥組，見圖5。

2.6 STAT3 抑制劑及Nam 對EMT 相關基因表達的影響 相比Ctrl 組，除Stattic 外的用藥組中TJP1mRNA 表達水平顯著升高，各用藥組SMAD3mRNA表達水平顯著降低。Nam 和Stattic 聯合用藥組中TJP1mRNA 表達水平顯著高于單獨用藥組，SMAD3mRNA表達水平顯著低于單獨用藥組，見圖6。

2.7 STAT3 抑制劑及Nam 對糖代謝相關基因的影響 相比Ctrl 組，單用藥組和聯合用藥組中糖酵解相關基因HK2、PFKL和PKMmRNA表達水平顯著降低；與S3I-201 單獨用藥組相比，Nam 和S3I-201 聯合用藥組中HK2、PFKL和PKMmRNA表達水平顯著降低；與單獨用藥組相比，Nam和Stattic 聯合用藥組中PKMmRNA 表達水平顯著降低。見圖7。相比Ctrl 組，單用藥組和聯合用藥組中葡萄糖轉運蛋白GLUT1mRNA表達水平顯著降低，除S3I-201外的用藥組中乳酸脫氫酶LDHAmRNA 表達水平顯著降低。且Nam 和S3I-201 聯合用藥組中LDHAmRNA表達水平顯著低于S3I-201單用藥組，Nam 和Stattic聯合用藥組中LDHAmRNA 表達水平顯著低于Stattic單用藥組。見圖8。

Fig.3 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on cell proliferation圖3 STAT3抑制劑及Nam對細胞增殖的影響

Fig.4 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of cell proliferation-related genes圖4 STAT3抑制劑及Nam對細胞增殖相關基因mRNA表達水平的影響

Fig.5 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of apoptosis-related genes圖5 STAT3抑制劑及Nam對細胞凋亡相關基因mRNA表達水平的影響

Fig.6 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of EMT-related genes圖6 STAT3抑制劑及Nam對EMT相關基因mRNA表達水平的影響

Fig.7 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of glycolysis-related genes圖7 STAT3抑制劑及Nam對糖酵解相關基因mRNA表達水平的影響

Fig.8 Effects of STAT3 inhibitor and Nam on the mRNA expression levels of GLUT1 and LDHA圖8 STAT3抑制劑及Nam對GLUT1和LDHA mRNA表達水平的影響

3 討論

相關研究表明，Stattic 和S3I-201 可以降低肺癌［7］、前列腺癌［10］和鼻咽癌［11］細胞中STAT3 Y705位的磷酸化水平，同時Nam可以降低肺癌細胞中Y705位的磷酸化水平［7］。本研究發現，單獨使用STAT3抑制劑或Nam均可以降低肝細胞癌HepG2中STAT3 Y705 位的磷酸化水平，抑制細胞增殖，且聯合用藥效果更顯著。

肝癌的發生與發展受多種因素的影響，細胞增殖和凋亡的失控是其中重要的環節。癌細胞的一個重要標志是具有無限的增殖能力。MCM7、MKI67和MYC是3 個與細胞增殖密切相關的基因，MCM7 是ATP依賴的DNA解旋酶，在DNA復制起始發揮重要作用，是細胞增殖活性的標志物［12］。MCM7 過表達可以促進肝細胞癌的增殖，其高表達與肝細胞癌不良的預后相關［13］。MKI67 是一個核蛋白，其在肝細胞癌中表達量升高［14-15］，敲低MKI67 可以抑制肝細胞癌的增殖［16］。MYC 在包括肝細胞癌在內的多種類型腫瘤中表達量上調［17］，在肝癌發生和肝細胞增殖中起著重要作用［18］。本研究發現STAT3抑制劑或者Nam 處理可以降低MCM7、MKI67和MYCmRNA表達水平，且聯合用藥效果更顯著。細胞凋亡是有機體為了維持自身內環境穩定而啟動的細胞程序性死亡的過程，這一過程受到BCL-2蛋白家族的調控，包括抗凋亡蛋白（如BCL-2、BCL-XL和MCL-1）以及促凋亡蛋白（如BAX和BAK）［19］。研究表明，肝癌組織中BCL-2 和MCL-1 高表達，BAX 低表達，腫瘤細胞凋亡受到抑制［20-21］。本研究發現，STAT3 抑制劑或者Nam 處理后，促凋亡基因BAXmRNA 表達量升高，抗凋亡基因BCL-2和MCL-1mRNA 表達量降低，且聯合用藥效果更顯著，提示STAT3抑制劑以及Nam可以通過促進細胞凋亡來抑制肝癌細胞增殖。

EMT是指上皮細胞向具有遷移和侵襲能力的間充質細胞轉化的過程，與腫瘤細胞增殖密切相關［22］。本研究發現，STAT3抑制劑或者Nam處理后，與EMT相關基因SNAIL1、VEGFA、ZEB1和SMAD3mRNA 表達量降低，TJP1mRNA 表達量升高，且聯合用藥效果更顯著。這些基因不僅在EMT 過程中發揮重要作用，還影響腫瘤細胞的增殖。TJP1是將跨膜的緊密連接蛋白和細胞質蛋白、肌動蛋白細胞骨架相連的支架蛋白［23］，肝癌組織中TJP1 表達下調，而過表達TJP1 可以降低肝癌細胞增殖，抑制細胞遷移［24］。SMAD3是EMT過程的關鍵調控因子，可以被轉化生長因子（TGF）-β 激活，從而啟動下游一系列與促進腫瘤細胞生長和侵襲相關基因的轉錄［25］。Snail1是EMT和細胞增殖的重要轉錄因子，可通過下調E-鈣黏蛋白，上調間充質細胞相關基因的表達來促進EMT 過程［26］。研究表明，過表達Snail1 可以通過上調細胞周期蛋白（Cyclin）D1 和增殖細胞核抗原（PCNA）的表達水平來促進腫瘤細胞增殖，反之亦然［27］。VEGFA是一種促進血管生成的生長因子，可以促進細胞遷移。研究表明，VEGFA在肝癌組織與肝癌細胞系中高表達［28］。在結直腸癌細胞中，VEGFA過表達可以促進細胞增殖［29］。在小鼠體內，VEGFA 過表達可促進肝癌生長，而抑制VEGFA 活性可以抑制肝癌生長［30］。ZEB1 是EMT 過程的關鍵轉錄因子，可以促進EMT 過程。研究表明，ZEB1 在肝癌細胞中高表達［31］，敲低ZEB1可以抑制肝癌細胞增殖［32］。因此，筆者認為STAT3抑制劑及Nam 可能通過調控EMT 相關基因的表達，抑制肝癌細胞增殖。

正常細胞主要依賴線粒體的氧化磷酸化來產生細胞所需的能量，而大部分的腫瘤細胞依賴于有氧糖酵解，即無論是否存在氧氣，腫瘤細胞都傾向于將大部分的葡萄糖轉化為乳酸，這一現象被稱為Warburg 效應［33］。Warburg 效應不僅可以為快速增殖的腫瘤細胞提供合成核酸、脂質以及蛋白的原料，還可以調節活性氧水平和腫瘤微環境，從而賦予腫瘤細胞生長上的優勢、耐藥性和轉移性［34］。本研究發現，STAT3 抑制劑及Nam 可以抑制糖酵解過程關鍵基因的表達水平，并抑制葡萄糖轉運蛋白GLUT1以及乳酸脫氫酶LDHA的表達，且聯合用藥效果更顯著。這提示STAT3 抑制劑及Nam 處理會導致糖酵解過程被抑制，減少乳酸生成，抑制Warburg 效應，從而影響肝癌細胞的能量代謝，抑制肝癌細胞增殖。

綜上，STAT3抑制劑及NAD 前體Nam 可以抑制肝癌細胞增殖，并且聯合用藥效果更顯著，進一步的機制研究表明，其對肝癌細胞增殖的抑制作用可能是通過對細胞增殖、凋亡、EMT及糖代謝相關基因表達水平的調控實現的，提示STAT3 抑制劑和Nam 聯合用藥可作為潛在的肝癌治療方案。