羅替加肽抑制糖尿病大鼠胃平滑肌自主收縮運動的實驗研究

孫海貝，包伊特格樂，張默函

糖尿病胃動力障礙是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，常表現(xiàn)為嘔吐、腹脹、腹痛［1］。長期的高血糖作用被認為是其主要的誘發(fā)因素，但具體發(fā)病機制尚未明確。胃平滑肌的自主收縮運動是胃動力的來源，而胞內(nèi)Ca2+增加是該運動的重要機制。胞內(nèi)Ca2+主要來源于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞外Ca2+攝入，其中胞外Ca2+除了受細胞膜的Ca2+通道調(diào)控外，縫隙連接（gap junction，GJ）也是重要的調(diào)控因素。研究證實，胃平滑肌細胞間存在豐富的GJ［2］。GJ主要由6個連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成，以Cx43的表達最廣泛。Cx43是一種分子質(zhì)量為43 ku的4次跨膜蛋白［3］，屬于α-Cx亞族。Cx43構(gòu)成縫隙連接半通道，其數(shù)量和磷酸化形式具有調(diào)節(jié)GJ 通透性的作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43 參與形成Ca2+可滲透的半通道，促進Ca2+內(nèi)流［5］。Cx43 絲氨酸368 位點（Cx43 Ser368）磷酸化能夠降低通道開放程度，調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+的水平［6-7］。Cx43 的磷酸化依賴其上游蛋白激酶C（PKC）調(diào)控，其中PKCα具有調(diào)控Cx43的功能［8］。羅替加肽是一種GJ 調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)羅替加肽能夠通過激活PKC促進心肌Cx43磷酸化，進而穩(wěn)定急性心肌梗死心肌縫隙連接傳導(dǎo)正常化［9］。因此，該藥被認為在預(yù)防缺血-再灌注誘導(dǎo)的室性心律失常和缺血性室性心動過速方面有一定的應(yīng)用前景［10-11］。而關(guān)于其對胃平滑肌自主收縮運動，尤其是糖尿病胃腸道的作用效果及機制至今少見報道。本實驗旨在探討羅替加肽對糖尿病胃平滑肌自主收縮運動的作用和可能的相關(guān)機制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 成年雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量（200±20）g，購于延邊大學(xué)實驗動物中心。鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma 公司）。羅替加肽（美國MCE 公司），Cx43 抗體、p-Cx43 Ser368抗體、PKCα 抗體、p-PKCα Thr497抗體（英國Abacm 公司），β-actin 抗體（美國Sigma 公司），辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（美國SantaCruz公司），細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒，BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型制備與實驗分組 用檸檬酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=4.0）配制0.5%的STZ 溶液。大鼠單籠飼養(yǎng)，相對濕度50%～80%，室溫18～25 ℃，自由飲水和進食，12 h明暗循環(huán)。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型組與正常對照組，每組6只。模型組大鼠禁食不禁水12 h，稱質(zhì)量后一次性腹腔注射65 mg/kg STZ，飼養(yǎng)條件不變。給藥7 d后尾靜脈取血，大鼠血糖＞16.7 mmol/L 提示糖尿病造模成功。6只正常對照組大鼠一次性腹腔注射等量的檸檬酸鹽緩沖液。實驗周期為8周。

1.2.2 離體肌條實驗觀察大鼠胃平滑肌自主收縮運動 大鼠禁食不禁水24 h后行安樂死，然后迅速剖取全胃，并立即放入4 ℃的氧飽和Kreb’s 液（NaCl 118 mmol/L、KCl 4.75 mmol/L、CaCl22.54 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L）中，漂洗出胃內(nèi)容物。小心剝離漿膜與黏膜，剪取胃竇部（其余胃組織液氮保存?zhèn)溆茫苽?.0 cm×0.2 cm 的肌條。肌條放置于裝有Kerb’s 液的垂直灌流槽內(nèi)（恒溫37 ℃，持續(xù)供給95%O2和5%CO2的混合氣體），一端固定在鉑絲鉤上，另一端連接張力換能器。每次實驗開始調(diào)節(jié)肌張力為1 g，平衡5 min，張力傳感器記錄肌力變化。待張力曲線產(chǎn)生且穩(wěn)定后加入羅替加肽（3 mmol/L），觀察并記錄正常對照組和模型組離體肌條的收縮運動變化。將加入羅替加肽處理后的肌條分別設(shè)為正常對照+羅替加肽組與模型+羅替加肽組，每組6 例，再次記錄張力曲線的變化。單位時間內(nèi)各組肌肉收縮的次數(shù)（波峰數(shù)目）為頻率，每次肌肉收縮的強度（波峰高度）為振幅。每一輪藥物實驗后，將羅替加肽作用后的離體肌條放置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Western blot 檢測膜蛋白、漿蛋白中相應(yīng)蛋白表達 分別取適量正常對照組、模型組以及模型+羅替加肽組的胃平滑肌組織，按照細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒要求進行操作。向裝有實驗用組織的離心管加入膜蛋白提取液A，充分混合后勻漿，冷藏10 min后，4 ℃、13 500 r/min離心30 min，提取上清液即為漿蛋白；繼續(xù)向該離心管加入膜蛋白提取液B，冷藏10 min后，4 ℃、13 500 r/min離心30 min，提取上清液即為膜蛋白。將提取的膜蛋白與漿蛋白分別于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗2遍，加入100～200μL預(yù)冷的裂解液，室溫吹打均勻，于冰上放置30 min 以使其充分裂解，96 孔板每孔加樣2μL待測蛋白、18μL雙蒸水和200μL蛋白濃度測定工作液（BCA工作液），測定蛋白樣品濃度。取待測蛋白煮沸2 min，40μg/孔加樣，10%十二烷基苯磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，利用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。滴加Cx43（1∶1 000）、p-Cx43 Ser368（1∶1 000）、PKCα（1∶1 000）、p-PKCα Thr497（1∶1 000）及β-actin（1∶500）抗體，4 ℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下孵育1 h，洗膜。凝膠成像分析系統(tǒng)曝光并分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，計算膜蛋白和漿蛋白中Cx43、PKCα，膜蛋白中p-Cx43 Ser368、p-PKCα Thr497的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃平滑肌頻率與振幅的比較 與正常對照組比較，模型組胃平滑肌自主收縮運動的振幅和頻率均降低（P＜0.05）。正常對照組與羅替加肽處理后的正常對照+羅替加肽組比較胃平滑肌自主收縮運動振幅和頻率無明顯變化；而羅替加肽處理后的模型+羅替加肽組的胃平滑肌自主收縮運動振幅和頻率較模型組均降低（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of frequency and amplitude of gastric smooth muscle in muscle strip experiment between the four groups表1 各組大鼠離體肌條實驗中胃平滑肌頻率及振幅的比較（n=6，±s）

Tab.1 Comparison of frequency and amplitude of gastric smooth muscle in muscle strip experiment between the four groups表1 各組大鼠離體肌條實驗中胃平滑肌頻率及振幅的比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a 與正常對照組比較，b 與模型組比較，P＜0.05；表2、3同。

組別正常對照組模型組正常對照+羅替加肽組模型+羅替加肽組F振幅（g）0.84±0.08 0.76±0.15a 0.78±0.04 0.25±0.20ab 25.802＊＊頻率（次/40 s）20.67±1.63 6.17±1.17a 19.83±0.48b 2.83±2.23ab 195.986＊＊

2.2 胃平滑肌Cx43 的相對表達量 與正常對照組比較，模型組膜蛋白Cx43 含量增加，漿蛋白Cx43 含量降低，Cx43的膜漿比增加（均P＜0.05），膜蛋白p-Cx43 Ser368含量增加（P＜0.05）；與模型組相比，模型+羅替加肽組膜蛋白Cx43 含量降低，漿蛋白Cx43含量增加，Cx43的膜漿比降低（均P＜0.05），膜蛋白p-Cx43 Ser368含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表2。

2.3 胃平滑肌PKCα的相對表達量 與正常對照組比較，模型組膜蛋白PKCα 含量降低，漿蛋白PKCα含量增加，PKCα的膜漿比降低（均P＜0.05），膜蛋白p-PKCα Thr497含量降低（P＜0.01）。與模型組比較，模型+羅替加肽組膜蛋白PKCα 含量、漿蛋白PKCα含量以及PKCα的膜漿比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而膜蛋白p-PKCα Thr497含量增加（P＜0.05），見圖3、表3。

3 討論

胃平滑肌細胞中的部分細胞具有起搏細胞功能，該細胞的興奮能夠通過細胞間廣泛存在的GJ向周圍的平滑肌細胞擴散，進而使這些平滑肌細胞隨著一起運動，形成一個運動單元［12］。胃平滑肌的自主收縮運動是胃動力的主要來源，而頻率和振幅則是胃平滑肌自主收縮運動的主要表現(xiàn)形式。長期的高血糖是導(dǎo)致糖尿病胃動力障礙的主要原因。Cai等［13］研究認為，糖尿病大鼠存在胃動力障礙，主要表現(xiàn)為胃平滑肌自主收縮運動的頻率變慢，而振幅不變。這與本實驗研究結(jié)果部分相同，考慮可能與糖尿病大鼠病程不同有關(guān)。

Fig.1 Frequency and amplitude of gastric smooth muscle in in vitro strip experiment in each group圖1 各組離體肌條實驗中胃平滑肌頻率及振幅

Fig.2 The expression levels of Cx43 in gastric smooth muscle of rats detected by Western blot assay in the three groups圖2 Western blot檢測各組大鼠胃平滑肌中Cx43的含量

Tab.2 Comparison of the expression levels of Cx43 in gastric smooth muscle of rats between the three groups表2 各組大鼠胃平滑肌中Cx43的表達水平比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of Cx43 in gastric smooth muscle of rats between the three groups表2 各組大鼠胃平滑肌中Cx43的表達水平比較（n=6，±s）

組別正常對照組模型組模型+羅替加肽組F Cx43（膜蛋白）0.44±0.15 0.90±0.25a 0.45±0.17b 10.943＊＊Cx43（漿蛋白）1.34±0.47 0.63±0.29a 1.19±0.26b 6.532＊＊Cx43（膜漿比）0.35±0.15 1.78±1.14a 0.39±0.16b 8.903＊＊p-Cx43 Ser368（膜蛋白）0.56±0.25 1.17±0.33a 0.94±0.30a 6.535＊＊

Fig.3 The expression levels of PKCα and p-PKCα Thr497 protein detected by Western blot assay in each group圖3 Western blot檢測各組PKCα和p-PKCα Thr497蛋白的表達

Tab.3 Comparison of PKCα protein expression levels in gastric smooth muscle of rats between the three groups表3 各組大鼠胃平滑肌中PKCα蛋白的表達水平比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of PKCα protein expression levels in gastric smooth muscle of rats between the three groups表3 各組大鼠胃平滑肌中PKCα蛋白的表達水平比較（n=6，±s）

組別正常對照組模型組模型+羅替加肽組F PKCα（膜蛋白）1.48±0.32 0.73±0.23a 0.71±0.21a 17.782＊＊PKCα（漿蛋白）0.59±0.17 0.97±0.08a 0.90±0.18a 10.571＊＊PKCα（膜漿比）2.83±1.51 0.77±0.27a 0.82±0.27a 10.254＊＊p-PKCα Thr497 1.32±0.19 0.77±0.12a 1.20±0.20b 16.361＊＊

PKCα 是經(jīng)典型蛋白激酶C 家族亞型。經(jīng)典PKC 又稱為Ca2+依賴型PKC，依賴Ca2+活化，也參與Ca2+通道的開放，影響胞外Ca2+的內(nèi)流，對細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化影響較大。研究認為，PKC 活化后通過上調(diào)細胞膜上Ca2+受體促進Ca2+內(nèi)流［14］。細胞膜上p-PKCα Thr497的磷酸化與PKCα 的比值水平可反映PKCα的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可能通過抑制細胞膜PKCα 活性，導(dǎo)致Ca2+的內(nèi)流下降，抑制平滑肌細胞收縮。細胞膜Cx43半通道數(shù)量可表現(xiàn)出對Ca2+的高滲透性［15］。Cx43 膜漿比可反映GJ 半通道的數(shù)量，Cx43 Ser368的磷酸化水平則反映GJ 半通道的開放率，而GJ半通道的開放率能夠反映細胞間物質(zhì)和信息傳遞情況。本研究認為，高血糖能夠增加胃平滑肌細胞間的GJ半通道的數(shù)量，可能為通過增加細胞間物質(zhì)和信息傳遞以及細胞外物質(zhì)進入胞內(nèi)來調(diào)節(jié)微環(huán)境的改變；但由于Cx43 Ser368磷酸化水平的增加降低了GJ 半通道的開放，導(dǎo)致細胞外Ca2+的攝入下降，進而使胃平滑肌自主收縮受到抑制。

羅替加肽是Cx43活性的重要調(diào)節(jié)劑，能夠阻止Cx43介導(dǎo)的縫隙連接解耦聯(lián)，臨床上常被用于多種心臟疾病的治療。Axelsen等［16］研究發(fā)現(xiàn)，羅替加肽可通過調(diào)節(jié)PKCα 活性改變Cx43 的磷酸化水平，進而改善心律失常。Kj?lbye 等［9］認為，應(yīng)激狀態(tài)下羅替加肽通過與其下游蛋白PKCα 作用，保護心肌細胞中Cx43磷酸化狀態(tài)，應(yīng)對心肌缺血時縫隙連接解偶聯(lián)。這表明羅替加肽主要通過Cx43 調(diào)控心肌細胞間的縫隙連接治療心臟疾病。胃平滑肌細胞間存在豐富的縫隙連接，而羅替加肽是否對糖尿病導(dǎo)致的胃動力障礙具有治療作用，少見文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，羅替加肽對糖尿病胃動力障礙非但不具有治療作用，反而還加劇抑制胃平滑肌自主收縮運動，直至運動停止。

細胞內(nèi)Ca2+增加是胃平滑肌細胞發(fā)生自主收縮運動的必需條件。Ca2+增加主要依靠細胞內(nèi)的Ca2+庫的釋放及胞外Ca2+攝入。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞內(nèi)的Ca2+庫，在胃平滑肌細胞自主收縮運動中發(fā)揮作用。研究認為，高糖條件下胃平滑肌細胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象［17］。這表明高糖狀態(tài)下胃平滑肌細胞的自主收縮運動所依賴的胞內(nèi)Ca2+只能依靠胞外Ca2+的攝入。羅替加肽能夠促進PKCα 的活化，而活化的PKCα 可通過磷酸化Cx43 調(diào)節(jié)GJ 的生物學(xué)功能。結(jié)合本研究結(jié)果，推測糖尿病狀態(tài)下羅替加肽通過活化胃平滑肌細胞膜PKCα，下調(diào)細胞膜Cx43 Ser368位點的磷酸化水平，進而下調(diào)GJ 半通道的開放率，同時降低GJ 半通道的數(shù)量；且PKCα 的這種通過Cx43抑制胞外Ca2+內(nèi)流的作用強于通過上調(diào)細胞膜上Ca2+受體促進Ca2+內(nèi)流的作用。

綜上所述，羅替加肽能夠通過PKC-Cx43 通路下調(diào)GJ 數(shù)量及GJ 開放率，減少胞外Ca2+內(nèi)流，進而抑制高糖狀態(tài)下胃平滑肌自主收縮運動。由于羅替加肽可用于多種心律失常的治療，本研究為探究羅替加肽的進一步臨床應(yīng)用價值提供了一定的實驗依據(jù)和理論依據(jù)。同時，本研究結(jié)果也表明羅替加肽應(yīng)用于糖尿病患者的心臟疾病治療過程中應(yīng)注意預(yù)防潛在的胃腸道不良反應(yīng)。