扶正化瘀方含藥血清對肝星狀細胞activinA/smad信號通路活化的影響

陳黎旭，熊佳，謝昆，朱挺德，鐘志英，官亮，潘永平△

肝纖維化是細胞外基質（ECM）降解和生成失衡導致ECM在肝內過度積聚，形成纖維性瘢痕的一種病理表現［1］。80%的原發性肝癌以“肝纖維化-肝硬化-肝癌”進展為特征［2］。世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的數據顯示，肝癌是全球癌癥相關死亡的第二大原因，在我國肝癌也是第二大致命性癌癥［3］。肝星狀細胞（HSC）是肝臟中主要的膠原生成細胞，當肝臟受到損害時，HSC 可被激活，合成并分泌大量ECM，促進肝纖維化形成，因此，活化的HSC在肝纖維化中起重要作用［4］。扶正化瘀方由丹參、蟲草菌粉、桃仁、絞股藍、松花粉和五味子組成，是國家食品藥品監督管理局批準的抗肝纖維化中藥方劑［5］。已有研究表明肝祖細胞中的激活素A（activinA）-smad-結締組織生長因子（CTGF/CCN2）軸可能是肝纖維化的潛在治療靶點［6］。也有研究表明扶正化瘀方可通過抑制HSC 中的轉化生長因子（TGF）-β1/smads 信號通路來發揮抗肝纖維化作用［7］。但有關扶正化瘀方通過影響HSC activinA/smad信號通路從而實現抗纖維化作用的研究較少。本研究采用扶正化瘀方含藥血清干預大鼠的HSC，探究其改善肝纖維化的可能機制，為臨床治療肝纖維化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6 購于中國科學院昆明細胞庫。20只雄性SPF級SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量250～280 g，7 周齡，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。本研究經江西中醫藥大學實驗動物科技中心動物實驗倫理委員會審查批準（批準號JZLLSC2018-0131）。扶正化瘀膠囊（上海黃海制藥公司，3 mg/粒，批號190312）；兔多克隆核因子-κB（NF-κB）p65 抗體購于美國Origene 公司；兔源胱天蛋白酶-3（caspase-3）抗體、smad3 單克隆抗體購于美國CST 公司；兔源activinⅡA 受體（ActRⅡA）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG、化學發光試劑盒購于愛必信生物科技有限公司；鼠源β-肌動蛋白（β-actin）抗體購于華安生物科技有限公司；PI 細胞凋亡周期試劑盒、山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）購于聯科生物科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購于上海翊圣生物科技有限公司；活性氧檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；Chemi Doc XRS型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；5810R型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；Gallios 型流式細胞儀（美國Beckman 公司）；Spectra Max i3 型酶標儀（德國Molecular Devices公司）。

1.2 含藥血清制備 將扶正化瘀膠囊中藥物粉末取出，稱質量，參考文獻［7-9］設定0.75 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg 扶正化瘀藥物劑量，根據大鼠灌胃容積10 mL/kg，用蒸餾水配制對應濃度藥物溶液給大鼠進行灌胃。大鼠在溫度23 ℃潔凈動物房適應性喂養1周。將大鼠按隨機數字表法分成4組，每組5只，分別為對照組、扶正化瘀（Fzhy）-低劑量含藥血清組（0.75 g/kg）、Fzhy-中劑量含藥血清組（1.5 g/kg）、Fzhy-高劑量含藥血清組（3.0 g/kg）。大鼠灌胃1 次/d，連續3 d，對照組灌服等體積的蒸餾水。末次給藥前禁食不禁水，給藥1 h后，眼眶取血，室溫靜置，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，56 ℃水浴滅菌30 min，0.22μm微孔濾膜過濾，-80 ℃保存備用。

1.3 細胞培養 采用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養基（添加1%青霉素/鏈霉素）于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養HSC-T6細胞，待細胞生長至融合度達到80%～90%時進行傳代，取生長狀態良好的細胞用于后續實驗。

1.4 CCK-8 法檢測細胞存活率及分組 在96 孔板中接種HSC-T6 細胞懸液，每孔100μL，細胞密度為1×105個/mL，培養24 h后吸去孔中培養基，加入5%、10%、20%不同體積分數的各組含藥血清［7-8］。培養24 h后，向每孔加入10μL CCK-8原液，放置培養箱中孵育1～2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度。細胞存活率（%）=（處理組吸光度值-調零組吸光度值）/（正常對照組吸光度值-調零組吸光度值）×100%。根據CCK-8結果，選取細胞存活率在50%左右的體積分數重新分組后進行后續實驗：Fzhy-低劑量含藥血清組（Fzhy-低劑量組）、Fzhy-中劑量組和Fzhy-高劑量組，設置對照組，將對數生長期的細胞按3×106/孔接種入6孔板中，培養24 h后，按照上述分組并給藥。

1.5 流式細胞儀檢測 （1）細胞周期及凋亡率。在37 ℃、5%CO2培養箱中培養各組細胞，孵育24 h后，收集細胞，用乙醇固定2 h，PBS 清洗2 次，每組加入0.5 mL 配制好的PI 染色工作液，混勻細胞，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率。（2）細胞線粒體膜電位變化。取0.5 mL的JC-1工作液重懸各組細胞，室溫避光孵育20 min后，再用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次，用0.5 mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞。流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位水平。（3）細胞ROS 水平。收集各組細胞，按照活性氧檢測試劑盒說明書每孔加0.5 mL 濃度為10 μmol/L 的熒光染料DCFHDA，避光37 ℃孵育20 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，用胰蛋白酶消化收集細胞，離心棄上清液，PBS 重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞ROS水平。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測mRNA 水平收集各組細胞，用Trizol 法提取細胞中總RNA，將RNA 反轉錄為cDNA，置于-20 ℃保存備用。采用qPCR 法檢測activinA、smad3、samd7、NF-κB mRNA表達，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。使用SYBR Select Master Mix 配制PCR 反應體系（20 μL），PCR 儀進行cDNA 擴增，反應條件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃10 s，共40 個循環。用2-ΔΔCt法計算activinA、NF-κB、smad7、smad3 mRNA相對表達量。

Tab.1 The primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.7 Western blot 檢測蛋白表達 收集各組細胞，200 μL RIPA裂解液提取總蛋白。將樣品放在沸水中加熱至蛋白完全變性，取出樣品冷卻至室溫，各組取等量的蛋白進行SDSPAGE電泳，PVDF膜轉印。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入ActRⅡA（1∶500），smad3、NF-κB p65、caspase-3（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后室溫孵育二抗（1∶2 000），化學發光法顯影處理、拍照，以β-actin 作為內參蛋白。ImageJ（v1.7.0）軟件對條帶進行定量分析，蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/參照蛋白灰度值。

1.8 統計學方法 使用GraphPadPrism 7.0 軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey Kramer檢驗。所有數據均為3次獨立重復實驗的平均值，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 扶正化瘀方對細胞存活率的影響 5%Fzhy-低、中、高劑量含藥血清組細胞存活率分別為（84.75±5.25）%、（79.59±2.93）%和（79.54±6.02）%；10%Fzhy-低、中、高劑量含藥血清組細胞存活率分別 為（72.56±8.10）% 、（59.63±7.48）% 和（59.23±8.90）%；20%Fzhy-低、中、高劑量含藥血清組細胞存活 率 分 別 為（51.52±1.93）%，（57.86±14.72）%和（40.23±4.84）%；對照組細胞存活率為（102.50±7.07）%。各扶正化瘀含藥血清組的細胞存活率均低于對照組（n=3，F=17.890，P＜0.05）。選擇體積分數為10%的含藥血清進行后續實驗。

2.2 扶正化瘀方對HSC-T6細胞周期及凋亡率的影響 對照組和各扶正化瘀方含藥血清組細胞周期和凋亡率差異均無統計學意義。見表2、圖1。

Tab.2 Comparison of HSC-T6 cell cycle and apoptosis rate between the four groups表2 各組HSC-T6細胞周期及凋亡率比較（%，±s）

Tab.2 Comparison of HSC-T6 cell cycle and apoptosis rate between the four groups表2 各組HSC-T6細胞周期及凋亡率比較（%，±s）

均P＞0.05。

組別對照組Fzhy-低劑量組Fzhy-中劑量組Fzhy-高劑量組F n3 3 3 3 G1 67.51±1.21 53.52±13.86 57.59±5.67 48.79±6.19 2.883 S 9.59±0.46 15.20±6.67 9.63±0.94 14.84±4.42 1.804 G2/M 19.01±1.68 21.82±6.77 19.82±6.94 24.56±5.44 0.581凋亡率2.71±0.60 8.38±1.46 9.08±3.39 10.35±6.44 2.475

2.3 扶正化瘀方對HSC-T6 細胞ROS 水平的影響 對照組及Fzhy-低、中、高劑量組細胞內ROS 水平分別為0.86±0.07、1.49±0.16、4.26±0.88 和8.92±0.94。與對照組相比，Fzhy-低、中、高劑量組細胞內ROS水平明顯升高，Fzhy-低、中、高劑量組細胞內ROS水平逐次升高（n=3，F=95.910，P＜0.05）。見圖2。

Fig.1 HSC-T6 cell cycle diagram of the four groups圖1 4組HSC-T6細胞周期

2.4 扶正化瘀方對HSC-T6細胞線粒體膜電位水平的影響 對照組及Fzhy-低、中、高劑量組細胞線粒體膜電位水平降低比例分別為（13.90±0.82）%、（37.93±0.67）%、（42.87±0.70）%和（49.80±1.02）%。與對照組相比，Fzhy-低、中、高劑量組線粒體膜電位水平降低比例明顯升高（P＜0.05）。Fzhy-低、中、高劑量組線粒體膜電位水平降低比例逐次升高（n=3，F=1 107.000，P＜0.05）。見圖3。

2.5 各組activinA/smad 信號通路相關基因表達水平比較 與對照組比較，Fzhy-中、高劑量組smad3 mRNA 表達水平降低，smad7 mRNA 升高，Fzhy-低、中、高劑量組NF-κB、activinA mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與Fzhy-低劑量組相比，Fzhy-中、高劑量組smad3 mRNA 表達水平降低，Fzhy-中劑量組activinA、smad7 mRNA 升高（P＜0.05）。Fzhy-低、中、高劑量組NF-κB mRNA 表達水平差異無統計學意義。見表3。

2.6 各組activinA/smad 信號通路相關蛋白及caspase-3 表達水平比較 與對照組比較，Fzhy-低、中、高劑量組smad3、NF-κB p65、ActRⅡA蛋白表達水平降低，Fzhy-低劑量組、中劑量組caspase-3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。Fzhy-低、中、高劑量組間smad3、NF-κB p65、ActRⅡA 蛋白表達水平差異無統計學意義。與Fzhy-低、中劑量組比較，Fzhy-高劑量組caspase-3 蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖4、表4。

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of activinA/smad signaling pathway in HSC-T6 cells between the four groups表3 各組HSC-T6細胞activinA/smad信號通路相關mRNA表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of activinA/smad signaling pathway in HSC-T6 cells between the four groups表3 各組HSC-T6細胞activinA/smad信號通路相關mRNA表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與Fzhy-低劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組Fzhy-低劑量組Fzhy-中劑量組Fzhy-高劑量組F smad3 1.00±0.05 0.88±0.12 0.38±0.03ab 0.36±0.03ab 68.390＊NF-κB 0.98±0.11 0.14±0.05a 0.26±0.08a 0.30±0.18a 32.700＊activinA 1.00±0.01 0.09±0.03a 0.52±0.09ab 0.32±0.20a 30.430＊smad7 1.03±0.28 1.58±0.08 2.27±0.09ab 1.90±0.35a 15.500＊

Fig.4 Effects of Fzhy on NF-κB p65,smad3,caspase-3,ActRⅡA protein expressions in HST-T6 cells圖4 扶正化瘀方對肝星狀細胞中NF-κB p65、smad3、caspase-3、ActRⅡA蛋白表達的影響

Tab.4 Comparison of NF-κB p65,smad3,caspase-3,ActRⅡA protein expression levels of HSC-T6 cells between the four groups表4 各組HSC-T6細胞NF-κB p65、smad3、caspase-3、ActRⅡA蛋白表達水平比較 （±s）

Tab.4 Comparison of NF-κB p65,smad3,caspase-3,ActRⅡA protein expression levels of HSC-T6 cells between the four groups表4 各組HSC-T6細胞NF-κB p65、smad3、caspase-3、ActRⅡA蛋白表達水平比較 （±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與Fzhy-低劑量組比較，c與Fzhy-中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組Fzhy-低劑量組Fzhy-中劑量組Fzhy-高劑量組F n3 3 3 3 NF-κB p65 3.08±0.21 2.55±0.17a 2.15±0.12a 2.12±0.21a 18.230＊smad3 2.68±0.18 1.92±0.11a 1.89±0.20a 1.79±0.31a 11.540＊caspase-3 0.71±0.09 1.50±0.21a 1.28±0.25a 0.67±0.25bc 11.600＊ActRⅡA 2.74±0.20 1.98±0.09a 1.80±0.26a 1.65±0.20a 17.930＊

3 討論

HSC-T6 細胞為活化的HSC，人與動物的HSC形態學、生長特點、標記物相似［10］。HSC-T6 在培養過程中表現出活化HSC 的特征，可作為抗肝纖維化藥物的細胞模型［8，11］。扶正化瘀方具有活血化瘀、益腎滋陰、養肝解毒的功效，是治療肝纖維化、肝硬化的臨床用藥。研究表明，扶正化瘀方的抗肝纖維化作用存在多成分、多效應、多靶點［12］。本研究探討了扶正化瘀方含藥血清對肝星狀細胞activinA/smad信號通路活化的影響。

ROS 為分子氧產生的自由基，是氧正常代謝的副產物，氧化應激是細胞內抗氧化能力和ROS 水平之間的失衡［13］。HSC 被ROS 激活后可產生一系列反應，最終導致肝纖維化的發生［14］。ROS 既可以直接促進肝纖維化的發生發展，又可以與炎癥反應、細胞自噬、細胞凋亡等病理生理過程相互作用，共同參與肝纖維化的發生發展［15］。高水平的ROS 可觸發細胞內的氧化應激，導致線粒體內膜的通透性增加，線粒體膜電位降低，腺苷三磷酸合成受到抑制，進而導致細胞內ROS水平明顯增加，反復循環，引發多種級聯反應，包括激活細胞凋亡信號通路，引發細胞凋亡［15］。本研究發現扶正化瘀含藥血清可促進HSC的氧化應激，升高線粒體膜電位水平降低比例。隨著扶正化瘀劑量的增加，HSC的ROS水平增加，氧化應激也越嚴重，細胞線粒體膜電位降低比例也升高。扶正化瘀含藥血清也可以降低HSC 的存活率，抑制其增殖。

caspase 家族在凋亡過程中必不可少，可分為起始者和執行者，caspase 執行者包括caspase-3、caspase-6 和caspase-7，可水解其靶蛋白，誘發細胞凋亡。同時caspase可作用于線粒體，在即將凋亡的細胞中形成一個線粒體-caspase-線粒體的正反饋放大回路，放大凋亡信號［16］。研究表明，抑制肝臟氧化應激及HSC活化、促進HSC凋亡是當前抗肝纖維化治療的有效策略［17］。本研究發現扶正化瘀含藥血清可激活caspase-3 參與的HSC 凋亡通路，但Fzhy-高劑量組與對照組差異無統計學意義。因扶正化瘀方抗纖維化作用存在多成分、多效應、多靶點，因此考慮高劑量的扶正化瘀方可能不是主要通過凋亡通路參與抗肝纖維化，而是激活了細胞內其他信號轉導通路，故需要進一步實驗探索不同扶正化瘀方劑量對細胞內其他信號轉導通路的影響。同時本研究中經含藥血清干預后，各組細胞周期和細胞凋亡率差異無統計學意義，考慮可能為給藥時間較短，后續可延長細胞給藥時間，進一步觀察細胞周期與凋亡情況。

activin 是具有廣泛生物學活性的細胞因子，與TGF-β 屬同一超級家族成員，有多種亞型，其中以activinA與肝臟疾病關系最為密切［18］。activinA主要通過增加HSC 的ECM 基因表達和翻譯或刺激HSC增殖、分化起作用［19］。研究表明activinA 可以通過刺激HSC 增殖參與肝纖維化的形成。activinA 可通過與激活素Ⅱ型受體（ActRⅡA 和ActRⅡB）的初始相互作用以及隨后激活Ⅰ型受體B（ActRⅠB）來激活典型的smad 信號，參與肝纖維化的形成，因此ActRⅡA 型受體是激活素信號傳導調控的關鍵。smad2、3是受體調節型smads，其能與激活素Ⅰ型受體結合，促進肝纖維化的形成［6，20］。smad7 是TGFβ1/Smad 信號轉導通路的抑制因子，具有抗肝纖維化的作用［21］。NF-κB 是介導炎癥反應的關鍵調節因子，可刺激肝巨噬細胞產生各種炎性因子，這些因子可擴大肝臟炎癥反應，也可促進HSC活化，進而加速肝纖維化形成［22］。本研究發現，扶正化瘀方能抑制activinA mRNA以及ActRⅡA蛋白的表達，也能抑制smad3、NF-κB蛋白，上調smad7 mRNA的表達，減輕炎癥反應，延緩肝纖維化進程，但各含藥血清組ActRⅡA、smad3、NF-κB 蛋白的表達差異無統計學意義，考慮含藥血清對細胞干預時間較短，可延長實驗時間，觀察各組含藥血清對activinA、ActRⅡA、smad3、smad7、NF-κB 的蛋白及mRNA 表達水平的影響。

綜上所述，扶正化瘀方含藥血清可通過影響HSC-T6細胞增殖，參與HSC-T6氧化應激以及調節activinA/smad 信號轉導通路來實現抗纖維化作用，本研究為扶正化瘀方應用于肝纖維化的治療提供了參考依據。