SPME Arrow-GC-MS鑒定3種不同殺菌乳中特征香氣物質

許凌云，侯陽，楊倩，李珍，段偉，張天軍，王鐵龍

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.河北農業大學，河北 保定071000；3.中國質量認證中心，北京 100070）

0 引言

目前，國內外采用的牛乳滅菌方式主要是兩種：巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌（Ultra-high Temperature Instantaneous Sterilization,UHT）[1]。巴氏殺菌一般是在72～85℃持續殺菌15 s[2]。UHT殺菌是在135～140℃，殺菌3～4 s[3]。蒸汽浸入式殺菌技術（Infusion Technology,INF）則是將殺菌溫度控制在145～158℃，殺菌時間小于1 s[4]。箭型固相微萃取（Solid-phase Microextraction Arrow,SPME Arrow）作為一項的新裝置，與傳統固相微萃?。⊿olid-phase Microextraction,SPME）纖維頭相比，其機械穩定性更強，吸附靈敏度更高，吸附分析萃取速度更快。而國內外關于INF殺菌牛乳中風味物質的研究較少，因此，以SPME Arrow為基礎，結合氣相色譜-質譜聯用，對乳源相同的巴氏殺菌乳、UHT滅菌乳和INF殺菌乳中風味物質進行檢測，探究不同殺菌方法對牛乳特征香氣物質的影響情況，為新的INF殺菌技術對牛乳中風味化合物的變化規律提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

由廠家提供奶源相同的巴氏殺菌全脂乳、UHT滅菌全脂乳和INF殺菌全脂乳，利用乳成分分析儀測定其蛋白質、脂肪和乳糖質量濃度，如表1所示。

表1 牛乳產品信息 g/100mL

氯化鈉（分析純）、氦氣（純度99.999%）、正構烷烴（C7～C40，色譜純）美國o2si smart solutions公司；2-甲基-3-庚酮（色譜純），美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；DB-WAX型毛細管柱（30 m×0.25 mm,0.25μm），美國Agilent公司；FT1型乳成分分析儀，丹麥Foss公司；SHJ-1AB磁力攪拌水浴鍋，長沙毫厘科技有限公司；箭型固相微萃取進樣器及DVB/CAR/PDMS（120μm×20 mm）的SPME arrow萃取頭，美國Agilent公司

1.3 實驗方法

1.3.1 箭型固相微萃取法

在頂空瓶中稱取10 g樣品乳，加入磁力攪拌子和1 g氯化鈉，用微量進樣器吸取1μL質量濃度為0.816 mg/mL的內標物2-甲基-3-庚酮打入樣品乳中。設置磁力攪拌水浴鍋的溫度為50℃、轉速為300 rpm。密封好的頂空瓶放入水浴鍋中加熱平衡20 min后，將SPME Arrow的萃取頭插入頂空瓶中，推出萃取纖維。待頂空吸附30 min后，縮回萃取纖維，并拔出萃取頭，等待GC進樣。

1.3.2 GC-MS分析方法

GC條件：毛細管柱的型號是30 m×0.25 mm，0.25μm的DB-WAX柱，以氦氣作為載氣，設置恒定流速為1.2 mL/min。色譜柱的升溫程序為：起始柱溫為35℃，溶劑延遲3 min，以5℃/min升溫到210℃，保持1 min；然后以10℃/min升到230℃，保持1 min；采用不分流模式。

MS條件：電子電離（electron ionization,EI）源，電子能量70 eV；進樣口溫度為250℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃；全掃描模式，質量掃描范圍是m/z35～350。

1.4 定性定量分析

1.4.1 定性分析

兩種方法來定性化合物：首先是在NIST14譜庫中檢索、對比化合物；然后是計算化合物的保留指數并與文獻中保留指數進行對比。保留指數的計算是將正構烷烴C7～C40與樣品牛乳在相同的色譜條件下得出GC保留時間，根據公式計算待測化合物i的保留指數（tn＜ti＜tn+1）。

式中：RI為保留指數；ti為樣品i的保留時間；n為碳原子數；tn+1為碳原子數為n+1的正構烷烴的保留時間；tn為碳原子數為n的正構烷烴的保留時間。

1.4.2 定量分析

利用內標半定量法來計算各揮發性風味化合物的含量，根據化合物與內標物質的峰面積比值來計算各揮發性風味化合物的含量。

2 結果與分析

本研究利用SPME Arrow萃取吸附巴氏殺菌乳、UHT滅菌乳和INF殺菌乳中揮發性風味組分，并借助GC-MS對這些風味物質進行分析和比較。分析結果顯示：3類殺菌乳中共檢測出78種揮發性風味物質，見表2。其中醛類物質最多有18種，其次是醇類14種，酮類12種，脂肪酸類11種等等。不同殺菌乳中揮發性化合物種類及質量分數存在明顯差異。其中巴氏殺菌乳主要是醛類化合物，其次是脂肪酸類和芳香及雜環類化合物；UHT滅菌乳中醛類和脂肪酸類種類最多，其次是酮類和內酯類；INF殺菌乳則是醛類、脂肪酸類和醇類居多。對表2中各類物質分別討論如下。

2.1 脂肪酸類化合物

脂肪酸類化合物的風味閾值較低，是牛乳中具有代表性的一類風味物質[5]。原料乳中游離脂肪酸主要有兩種來源[6]：（1）瘤胃細菌分泌的乙酸和β-羥基丁酸在乳腺內合成了短鏈和中短鏈脂肪酸（C4-C10和C16的一半）；（2）更長的脂肪酸（C16或更長）則是從食物轉移到乳腺中生成。3種殺菌方式的分析結果顯示：巴氏殺菌乳中共檢測出9種脂肪酸類化合物，UHT滅菌乳中10種，INF殺菌乳中10種，由此可見不同殺菌方式對脂肪酸類化合物的種類數量影響并不大。但部分脂肪酸類物質只存在于特定種類的殺菌乳中，如：丙酸只存在于INF殺菌乳中；庚酸只在UHT滅菌乳和INF殺菌乳中被檢索出；而9-癸烯酸也只能在巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中獲得。通過計算可知：UHT滅菌乳中脂肪酸總質量分數明顯高于INF殺菌乳和巴氏殺菌乳。這與目前已有的結論相似：137℃，4 s加熱處理后的UHT滅菌乳中脂肪酸質量分數明顯增加[7]。3類殺菌乳中，己酸、辛酸和癸酸的質量分數都相對較高。其中，UHT滅菌乳中辛酸質量分數高達45.48μg/kg。這些中短碳鏈的脂肪酸在低濃度時具有奶香味，是牛乳中典型的揮發性風味組分。

2.2 內酯類化合物

內酯類化合物通常是加熱后羥基化的脂肪酸經環化反應生成[8]，是牛乳整體風味形成中的重要一員。由表2可知：3類殺菌乳中共檢測出7種內酯類物質。巴氏殺菌乳2種，UHT滅菌乳7種，INF殺菌乳3種，其中，δ-癸內酯和δ-十二內酯均存在于3類殺菌乳中。由上述結果可知：UHT滅菌乳中內酯類化合物數量上遠高于INF乳和巴氏殺菌乳，這可能是因為UHT滅菌乳的高溫處理更容易生成內酯類風味化合物[9-10]。內酯類物質與滋氣味和風味有著密切關系，其能賦予牛乳愉悅的脂肪香氣，如椰奶味、桃子味等。內酯類物質能賦予牛乳良好的風味[11]，其對提高牛乳的感官品質具有積極作用。3類殺菌乳中，δ-癸內酯的質量分數均為最高，在UHT滅菌乳、INF殺菌乳和巴氏殺菌乳中分別是5.85、4.68μg/kg和1.40μg/kg。此外，由表2可知，UHT滅菌乳中內酯類總質量分數明顯高于INF殺菌乳和巴氏殺菌乳，這表明內酯類組分是形成UHT滅菌乳的主要風味化合物，其對UHT滅菌乳的風味具有重要貢獻[11]。

2.3 酮類化合物

酮類物質作為牛乳中最常見的風味化合物，其感知閾值低、風味特別，是牛乳風味組分中關鍵的一員[12-13]。牛乳中酮類物質主要有兩種產生途徑：第一種是天然存在于生牛乳中；第二種則是飽和脂肪酸或β-酮酸在高溫處理過程中通過氧化脫羧生成。由表2可知，3種殺菌方式的牛乳中共檢測出12種酮類物質。UHT滅菌乳9種，INF殺菌乳6種，巴氏殺菌乳6種。UHT滅菌乳中酮類物質總質量分數和種類均遠高于INF殺菌乳和巴氏殺菌乳，這與相關組分高溫生成機制有關。此外，部分酮類物質只存在于一類殺菌乳中。如2-戊酮只存在于UHT滅菌乳中，4-辛酮也只存在于巴氏殺菌乳中。部分物質雖然存在于3類殺菌乳中，但其質量分數有著較大的區別。如常見的甲基酮類物質2-壬酮和2-庚酮：2-壬酮在UHT滅菌乳中質量分數高達35.64μg/kg，INF殺菌乳中為4.91μg/kg，巴氏殺菌乳中則為2.35μg/kg。2-壬酮感知閾值較低，僅為0.02 mg/kg，具有的熱牛奶味道對牛乳的感官品質起著積極作用；2-庚酮在UHT滅菌乳中質量分數為36.50μg/kg，INF殺菌乳中1.76μg/kg，巴氏殺菌乳中則為2.68μg/kg。這與V-L等人[14]研究的結論一致：UHT滅菌乳中，2-壬酮和2-庚酮的質量分數遠高于巴氏殺菌乳。除了質量分數和種類上的差異，UHT滅菌乳還會賦予牛乳多種獨特的香氣物質，如：由亞油酸氧化產生的2-庚酮，就賦予UHT滅菌乳奶油香氣，其既是UHT滅菌乳風味物質的主要組成部分，也是UHT滅菌乳中獨特的風味化合物；2-戊酮則具有輕微的乳樣香氣和果香甜味[15]。

2.4 醛類化合物

醛類物質的氣味閾值一般都較低，如常見的辛醛，其閾值是0.587μg/kg，反-2-壬烯醛的閾值為0.19μg/kg，而十二醛的閾值僅為0.14μg/kg。但醛類物質在食品中起著關鍵作用并且可以作為一種風味前體通過化學反應產生各種氧化風味組分[16]。Strecker降解、氨基酸的轉氨作用以及脂肪酸的代謝產生了醛類物質[14]。3種殺菌方式的分析結果表明：UHT滅菌乳中共檢測出11種醛類化合物，INF殺菌乳12種，巴氏殺菌乳13種。其中糠醛和肉桂醛只在UHT滅菌乳中被檢索到，反式肉桂醛和反-2-癸烯醛也只在INF殺菌乳中被發現，丙醛、庚醛和十一醛只在巴氏殺菌乳中出現。且通過計算可知：3類殺菌乳中，壬醛、癸醛和苯甲醛的含量占比都較高。如：UHT滅菌乳中，壬醛質量分數高達4.95μg/kg，占其醛類總質量分數的23.5%；INF殺菌乳中壬醛質量分數為18.67μg/kg，占其醛類總質量分數的46.3%；巴氏殺菌乳中壬醛質量分數為67.40μg/kg，占其醛類總質量分數的67.6%。醛類物質作為加熱后的牛乳中香氣組分的重要貢獻者，其風味獨特。常見的醛類物質中，苯甲醛有水果香、堅果香，呈現出苦杏仁香味和焦味，對牛乳整體風味的形成起著重要作用[7]；糠醛則有面包香和焦香，帶有烘烤食物的味道；庚醛是堅果香氣；己醛則是強烈的青草和果木香氣[17]。

2.5 醇類化合物

在牛乳中，相應的醛類物質通常會通過物理作用或者是酶作用生成醇類物質[18]。醇類物質具有植物香、芳香、土氣和酸敗味，但其閾值較高，除非是在不飽和狀態或者是以高濃度存在時，才會對牛乳的風味做出貢獻[16]。由表2可知：UHT滅菌乳和INF殺菌乳中醇類物質種類上略高于巴氏殺菌乳，而INF殺菌乳中醇類物質的總質量分數則高于巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳。3類殺菌乳中，均存在1-辛醇、芳樟醇、十二醇和十四醇。醇類化合物對牛乳香氣的影響幾乎可以忽略不計，因為它們的味道相對較弱[18]。

2.6 酯類化合物

牛乳加熱過程中脂肪酸發生了一系列化學反應，生成了酯類物質。酯類物質通常是短鏈脂肪醇和游離脂肪酸通過酯化反應獲得[5]。如：常見的乙酸乙酯就是牛乳加熱過程中，乙酸和乙醇通過酯化反應獲得[19]。由C1～C20脂肪酸組成的甲酯或乙酯類是牛乳中主要的酯類物質[15]，其對牛乳風味有一定的影響[20-21]。由表2可知：UHT滅菌乳和INF殺菌乳中均只檢測出十六酸甲酯這一酯類物質，這與楊楠等人[15]檢測的結果相似。除十六酸甲酯外，巴氏殺菌乳中還檢測出丁酸丁酯、己酸乙酯和己酸丁酯，這可能與其較高的脂肪含量有關。3類殺菌乳中，酯類化合物總質量分數均較低，INF殺菌乳中酯類總質量分數是1.35μg/kg，巴氏殺菌乳是3.23μg/kg，UHT滅菌乳中僅為0.42μg/kg。

2.7 含硫化合物

含硫化合物感知閾值較低，是加熱后牛乳產生蒸煮味道（cooked flavor）的重要原因，因而含硫化合物對乳制品風味的影響較大。揮發性硫化物主要通過乳清蛋白因加熱變性而暴露的甲硫氨酸中的巰基發生Strecker降解生成。如甲硫醇就來自于甲硫氨酸和核黃素的Strecker降解[22]，甲硫氨酸的Strecker降解也產生了痕量的二甲基二硫和二甲基硫[23]，此外，其它含硫化合物如硫化氫，除了甲硫氨酸的降解外[24]，還有兩種可能的形成機制：雙酮存在下的半胱氨酸的Strecker降解或者是硫胺的熱降解[22]。由表2可知：UHT滅菌乳中共檢測出二甲基三硫和二甲基砜這兩種含硫化合物，其中二甲基三硫具有硫磺味和卷心菜的味道，對牛乳風味有一定的貢獻，尤其被認為是UHT滅菌乳中含硫風味的主要來源[23]；INF乳中則只有二甲基砜；巴氏殺菌乳中是二甲基三硫和二甲基亞砜，其中二甲基亞砜具有硫磺味和大蒜味。此外，3類殺菌乳中，含硫化合物的總含量相差也不大。

2.8 3類殺菌乳中主要香氣化合物組分的OAV分析

將表2中鑒定得到的風味化合物進行OAV計算（閾值見文獻），其中OAV>1的物質如表3所示。UHT滅菌乳中，OAV值在1-10的化合物主要是內酯類、酮類和醛類等化合物，包括γ-十二內酯（OAV=1.63），順式-4-羥基-6-十二烯酸內酯（OAV=4.20），2-庚酮（OAV=1.22），2-壬酮（OAV=1.78），2-十一酮（OAV=2.91），辛醛（OAV=3.75），壬醛（OAV=4.50），十二醛（OAV=5.86），二甲基三硫（OAV=2.20）。INF殺菌乳中，OAV大于10的是1-辛烯-3-酮和壬醛，分別是73.33和16.97；OAV在1-10的化合物主要是醛類和醇類，包括辛醛為4.82，反-2-壬烯醛是4.53，芳樟醇是1.00。巴氏殺菌乳中，OAV大于10的化合物是辛醛和壬醛，其OAV值分別是13.83和61.27；OAV在1-10的化合物主要是酯類和醛類，包括己酸乙酯（OAV=1.33），庚醛（OAV=1.41），癸醛（OAV=2.33），反-2-壬烯醛（OAV=7.26），十二醛（OAV=7.50），芳樟醇（OAV=2.18），二甲基三硫（OAV=2.90）。

表2 UHT滅菌乳、INF殺菌乳和巴氏殺菌乳的化合物定量結果

（續表2）

（續表2）

3類殺菌乳中，均有2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、辛醛、壬醛、癸醛、芳樟醇這7種化合物。此外，乙酸乙酯和庚醛只存在于巴氏殺菌乳中，γ-十二內酯和順式-4-羥基-6-十二烯酸內酯也只出現在UHT滅菌乳中。1-辛烯-3-酮只存在于INF殺菌乳中。十二醛和二甲基三硫也只出現在UHT滅菌乳和巴氏殺菌乳中。其中，1-辛烯-3-酮因其感知閾值低，僅為0.003μg/kg，其在INF殺菌乳中OAV值大于10，為INF殺菌乳貢獻了蘑菇般的氣味；3類殺菌乳中，壬醛的OAV值均較大，其為3類殺菌乳貢獻了脂肪香氣。且由表3可知，UHT滅菌乳的整體風味主要是由內酯類和酮類組成，INF殺菌乳則是由酮類構成，醛類物質構成了巴氏殺菌乳的整體風味。

表3 牛乳中化合物的OAV值

2.9 3類殺菌乳中揮發性風味組分的熱圖分析

進一步探討不同殺菌方法對牛乳中特征香氣物質的影響，將表3所列的揮發性風味組分的OAV值進行熱圖分析，得到如圖1所示結果。圖中藍色越深表示對牛乳風味貢獻越大，紅色越深表示對牛乳風味貢獻越小。由圖1可以看出，巴氏殺菌乳中，醛類化合物對其整體風味影響最大，以辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛和十二醛為代表的特征香氣物質基本構成了巴氏殺菌乳的整體風味；UHT滅菌乳中主要揮發性風味化合物是內酯類、酮類和醛類，其中γ-十二內酯、順式-4-羥基-6-十二烯酸內酯、2-壬酮、2-十一酮以及辛醛、壬醛等特征香氣物質構成了UHT滅菌乳的整體風味；以1-辛烯-3-酮和壬醛為代表的酮類和醛類物質基本構成了INF殺菌乳的整體風味。

3 結論

本文通過SPME Arrow-GC-MS對3種殺菌方式的牛乳進行分析，得出以下結論：3類殺菌乳中共檢測到78種揮發性風味物質，其中脂肪酸類11種、酯類4種、內酯類7種、酮類12種、醛類18種、醇類14種、含硫化合物2種、芳香及雜環類化合物10種。其中OAV>1的風味物質共15種，利用這15種揮發性風味物質的OAV值做熱圖分析，分析結果顯示：不同殺菌乳中特征香氣物質存在明顯差異。巴氏殺菌乳中，醛類化合物對其整體風味影響最大，以辛醛、壬醛、反-2-壬烯醛和十二醛為代表的風味化合物基本構成了巴氏殺菌乳的整體風味；UHT滅菌乳中主要揮發性風味化合物是內酯類、酮類和醛類，其中γ-十二內酯、順式-4-羥基-6-十二烯酸內酯、2-壬酮、2-十一酮以及辛醛、壬醛等特征香氣物質構成了UHT滅菌乳的整體風味；以1-辛烯-3-酮和壬醛為代表的酮類和醛類物質基本構成了INF殺菌乳的整體風味。