斑馬魚胚胎眼睛石蠟切片的制作和蘇木素-伊紅染色

楊 晨

（浙江大學醫學院附屬口腔醫院，浙江 杭州 310000）

斑馬魚由于體積小，身體幾乎是透明的，性成熟快，易繁殖等優勢，越來越多地應用于基因組學、發育生物學、功能組學、神經生物學、毒理學研究等，成為科研工作者的重要模式生物選擇[1-3]。目前有關斑馬魚的研究主要集中在成年斑馬的魚鰓、端腦、中腦、腸道、心臟、動脈球組織和肝等組織結構[4-8]，而關于斑馬魚胚胎眼睛組織結構的研究還鮮見報道。斑馬魚的眼睛在形態發育、解剖學結構及功能學等方面與人類存在著很大的相似性，并具有易于繁殖、生長發育較快、眼睛較大、易于觀察等優勢，因此，斑馬魚成了研究人類眼睛發育和眼睛疾病的一種理想模式生物[9]。斑馬魚胚胎眼睛作為理想的眼病動物模型，對了解眼睛疾病的發病機制和研發治療藥物具有重要的參考價值。本實驗制作了斑馬魚胚胎眼睛石蠟組織切片，并且采集光鏡圖譜進行組織結構比較分析，旨在為斑馬魚胚胎的形態學及相關研究提供技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象

本文分享的案例實驗中所用為野生型斑馬魚（Danio rerio）AB 品系，保持14h/10h 光暗周期循環條件，雌雄魚交配產生的受精卵在魚水（0.33g/L 海鹽）（30%Dan ieau buffer），28.5℃恒溫箱培養，繼續飼養至受孕后120 h（hour post-fertilization，120hpf）。

1.1.2 試劑與器材

甲醛（分析純，國藥），無水乙醇（分析純，國藥），二甲苯（AR，國藥），石蠟（60-62℃（滬試），國藥），蘇木素染色液（蘇木素2.5g，純乙醇25mL,鉀明礬50g，蒸餾水500mL，氧化汞1.25g，冰醋酸20 mL），伊紅染色液（伊紅Y0.25g，蒸餾水100mL，冰醋酸50μL），鹽酸乙醇分化液（70%乙醇100mL 內加入1mL 濃鹽酸混勻即可）；真空脫水機（ASP 200S型，徠卡），石蠟包埋機（Leica EG 1150，徠卡），石蠟切片機（RM 2235 型，徠卡），Leica 自動封片機（CV 5030 型，徠卡），體式顯微鏡（Nikon SMZ18），自制玻璃彎勾（此工具為玻璃電極吹制而成，具有很細的彎勾），正置熒光顯微鏡（Leica DM 4000）。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制作流程

固定和脫水：將收集到的斑馬魚胚胎在4%甲醛溶液中室溫固定24h。固定完成后，將斑馬魚胚胎小心取出，用擦鏡紙包裹好放入包埋盒內，自來水沖洗，放在脫水機內進行脫水、透明、浸蠟，程序依次為：70%乙醇，1h →85%乙醇，2h →95%乙醇，2h →95%乙醇，2h →無水乙醇Ⅰ，4h →無水乙醇Ⅱ，4h →二甲苯Ⅰ，30min →二甲苯Ⅱ，30min →二甲苯Ⅲ，1h →石蠟Ⅰ、62℃，1h →石蠟Ⅱ、62℃，3h →石蠟Ⅲ、62℃，4h。

蠟塊包埋：將樣本取出放入熱蠟中，取不銹鋼小底模具置于熱臺上，借助體式顯微鏡進行觀察，將斑馬魚頭部沖下進行包埋，使用自制玻璃彎勾不斷調整斑馬魚方向，直至其頭部與模具底部垂直，輕輕將模具轉移至冷臺，等待石蠟冷卻，包埋完成。

切片：將包埋好的蠟塊固定在切片機上，切片厚度設置為3μm，修掉多余的石蠟，借助體式顯微鏡觀察，調整樣本固定角度。切片結束后，將切片放到60℃烘箱內過夜烤片。

圖1 正常120 hpf 斑馬魚胚胎圖（A：比例尺示500μm；B：比例尺示100μm）

表1 石蠟切片的脫蠟、染色、脫水和透明過程

1.2.2 斑馬魚胚胎眼睛石蠟切片的HE 染色步驟

石蠟切片依次經過脫蠟、水化、HE 染色、脫水、透明等步驟完成染色，具體如下：

脫蠟：切片60℃干烤過夜后，進入二甲苯進行脫蠟，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min；然后進行水化：無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各1min，蒸餾水3min；蘇木素-伊紅染色過程如下：蘇木素染液染色5min，自來水藍化5min，鹽酸酒精分化液分化5s，流水沖洗10min，蒸餾水3min，伊紅染液染色2min →水洗。

脫水和透明：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ梯度脫水1min；隨后二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1min。最后用全自動封片機常規封片，并使用正置顯微鏡觀察和采集切片圖像。

2 結果

2.1 石蠟切片的質量

圖2 顯示：石蠟切片完整，薄厚均勻一致，沒有褶皺和刀痕，沒有裂痕和破損；清晰顯示了組織的正常形態結構。

圖2 正常120hpf 斑馬魚胚胎眼睛切片HE 染色圖（比例尺：50μm）

2.2 切片的染色情況和染色結果分析

通過不斷調整，我們制作出結構清晰的眼睛HE 切片（圖3）。圖中標注的結構依次為：晶狀體（Lens），視神經（optic nerve，ON），視網膜色素層（retinal pigment epithelia，RPE），外核細胞層（outer nuclear layer，ONL），內核細胞層（inner nuclear layer，INL），內網層（inner plexiform layer，IPL)，背部邊緣區（dorsal marginal zone，dMZ），腹部邊緣區（ventral marginal zone，vMZ）以及視神經節細胞層（ganglion cell layer，GCL）。

圖3 受孕后120h 斑馬魚胚胎眼睛切片HE 染色圖（比例尺：50μm）

染色后細胞核質分明，染色對比度好，透明潔凈等要求，能夠保持細胞間的正常相互關系，清晰顯示組織細胞的形態結構，真實地展示組織形態學結構。

3 討論

斑馬魚胚胎體型小，身體透明度高，脫水處理后體積更小，包埋難度大，需要借助體式顯微鏡進行放大后才能有效地確立滿意的包埋方向，完成胚胎包埋。由于組織體積的特殊性和眼睛切片要求的高難度，樣本數量需要準備多一點，包埋和切片工作還要求技術和經驗，更需要耐心。另外，包埋過程中，對溫度的要求很高，在調整好包埋方向之前，需要將樣本一直放置在熱臺上，保持62℃，防止石蠟遇冷凝固。稱手的彎頭玻璃勾有個很細的尖頭，很適合用來調整胚胎的包埋方向，當然大家也可以嘗試其他有尖頭的工具。至于修片，當修出組織后，及時調整切片厚度，避免組織過多地被修掉。

斑馬魚胚胎眼睛切片的制作好壞與質量，直接關系到后續的HE 染色以及免疫熒光等實驗效果。染色需要通過在鏡下觀察染色效果進行調整，以保證染色質量。對于脫水后體長只有幾毫米的斑馬魚胚胎，正常斑馬魚胚胎眼睛最大直徑只有180 微米，切片難度可想而知[10]。

我們通過不斷測試，摸索出一套實用的切片和染色方法，希望能夠為從事斑馬魚胚胎眼睛石蠟切片的研究者提供參考。