犬ANP32蛋白多態性及其對A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

2022-07-27 06:47:26于萌萌孫留克劉荻萩張海麗王曉鈞

中國畜牧獸醫 2022年7期

張媛,于萌萌,孫留克,郭興,那雷,劉荻萩,姜騫,張海麗，2,王曉鈞

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所,獸醫生物技術國家重點實驗室,哈爾濱 150069；2.吉林大學動物醫學學院,人獸共患病研究教育部重點實驗室,長春 130062)

A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一種單股、分節段負鏈RNA病毒，亞型多且在全球范圍內廣泛傳播[1]。野生水禽被公認為是A型流感病毒最大的天然儲存庫[2]。在特定條件下，A型流感病毒可突破種間屏障感染其他宿主，如感染人、家禽、豬、犬、馬等宿主[3-5]。近年來，養殖場經常出現馬/犬或犬/禽混合飼養，因此，當有禽流感或馬流感暴發時，病毒經不斷變異和重組，有可能跨種傳播到犬[6-7]，引起犬呼吸系統傳染性疾病，威脅動物的生命健康，造成嚴重的社會經濟損失，甚至有潛在大流行風險。

RNA聚合酶的適應性是影響A型流感病毒跨物種傳播的重要因素之一[8-10]。2016年，Long等[11]首次揭示了禽流感病毒RNA聚合酶在不同宿主細胞中的適應性與雞酸性核磷蛋白32A(chicken acidic(leucine-rich)nuclear phosphoprotein 32 ku，chANP32A)種屬特異性相關。隨后有研究報道禽源ANP32A基因存在多態性，且不同的ANP32A剪接變體對禽流感病毒RNA聚合酶的適應性和病毒進化的驅動力不同[12-13]。中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所馬傳染病與慢病毒病創新團隊前期已從眾多宿主因子中篩選并證明宿主因子ANP32A和ANP32B是A型流感病毒RNA聚合酶活性的決定性宿主蛋白，且存在種屬特異性[14-15]。犬腎傳代細胞系MDCK對不同物種來源的多種亞型的流感病毒株均易感，常用來進行流感病毒的分離及疫苗的研發生產[16]。但目前關于犬ANP32(caANP32)蛋白對不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響報道較少。

本研究克隆并表達了caANP32家族成員caANP32A、caANP32B及caANP32E，初步分析了caANP32A、caANP32B及caANP32E蛋白組織分布及在MDCK細胞中的多態性。利用流感病毒RNA聚合酶雙熒光報告系統探索caANP32家族蛋白對不同物種來源的A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響，以期為開發應用于疫苗生產、病毒分離等高效犬腎細胞系MDCK提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源犬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、氣管、盲腸、大腦組織樣品均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所自然疫源性人獸共患病研究創新團隊保存。

1.1.2 質粒及毒株雞ANP32A/B(chANP32A/B)、人ANP32A/B(huANP32A/B)、豬ANP32A/B(swANP32A/B)、馬ANP32A_X2/32B(eqANP32A_X2/32B)、犬ANP32A/B/E(caANP32A/B/E)的表達質粒及人胚腎細胞(HEK293T，CRL-3216)、人胚腎細胞ANP32A/B雙基因敲除細胞系(DKO,CRL-3216)、犬腎細胞系MDCK(CCL-34)均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所馬傳染病與慢病毒病創新團隊保存。

犬流感毒株A/canine/Guangdong/1/2011(H3N2GD11)聚合酶為廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室饋贈；禽流感病毒A/chicken/Zhejiang/1/2012(H9N2ZJ12)聚合酶由中國農業科學院上海獸醫研究所動物流感與禽新發病毒病團隊饋贈；馬流感毒株A/equine/Jilin/1/1989(H3N8JL89)聚合酶由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存。上述流感病毒RNA聚合酶報告系統真核表達質粒均構建于pCAGGS-Flag表達載體上。含有人Pol Ⅰ啟動子的螢火蟲熒光素酶基因報告質粒pEZ-vLuc、含有海腎熒光素酶基因的內參質粒pRL-TK均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所馬傳染病與慢病毒病研究創新團隊制備并保存。

1.1.3 主要試劑及儀器 Trizol、反轉錄酶試劑盒和KOD PCR酶試劑盒(TOYOBO公司)；質粒小量提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒和膠回收試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、胰蛋白酶、Opti-MEM減血清培養基和蛋白質分子質量標準(Thermo Fisher公司)；鼠源抗Flag標簽單克隆抗體和鼠源抗β-actin單克隆抗體(Sigma-Aldrich 公司)；硝酸纖維素膜(NC膜)(Millipore公司)；In-Fusion連接酶試劑盒(Clontech公司)；Simply P總RNA提取試劑盒、實時熒光定量PCR TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)；雙熒光素酶試劑盒(Promega公司)；細胞消化胰酶(Gibco公司)；聚乙烯亞胺P轉染試劑、細胞裂解液(150 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaCl、1% Triton X-100)以及5×蛋白上樣buffer(0.25 mol/L Tris-base、50%甘油、10% SDS、0.5%溴酚藍、0.1 MDTT)均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所馬傳染病與慢病毒病創新團隊配制及保存。

1.2 方法

1.2.1 組織、細胞RNA提取及反轉錄組織RNA提取：將犬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、氣管、盲腸及腦組織分別取約0.1 g剪成小塊，按照Trizol法RNA提取試劑盒說明書提取組織基因組RNA，以隨機引物按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA。MDCK細胞RNA提取:按照Simple P總RNA提取試劑盒說明書提取1×106個MDCK細胞總RNA，取1 μg RNA按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA。

1.2.2 引物設計及合成基于GenBank數據庫登錄的caANP32家族基因序列caANP32A(NM_001003013)、caANP32B_X1(XM_022425638)、caANP32B_X2(XM_014117879)、caANP32B_X3(XM_005626854)、caANP32E_X1(XM_022404962)和caANP32E_X2(XM_003639621)，針對caANP32基因開放閱讀框分別設計實時熒光定量PCR(表1)和基因克隆所需的特異性引物(表2)。引物均由吉林庫美有限公司合成。

表1 caANP32基因實時熒光定量PCR引物信息

表2 caANP32基因克隆引物信息

1.2.3caANP32A、caANP32B和caANP32E基因組織分布以1.2.1獲得的組織cDNA為模板，采用表1基因特異性引物進行實時熒光定量PCR。反應體系20 μL：TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)10 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.4 μL。反應程序:95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。

1.2.4caANP32A、caANP32B和caANP32E基因克隆和真核表達質粒的構建以1.2.1獲得的心臟組織cDNA和MDCK細胞cDNA分別作為模板，用表2特異性引物進行PCR反應，擴增caANP32全長目的基因。PCR反應體系50 μL：2×PCR Buffer 25 μL，dNTPs 10 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，模板200 ng，KOD FX 酶 1 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min;98 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表2)30 s，68 ℃延伸90 s，共35個循環；68 ℃延伸10 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶純化后，通過In-fusion試劑盒連接于真核表達載體pCAGGS-Flag，經測序正確后進行質粒提取以獲得相應的重組質粒。

1.2.5 細胞轉染將HEK293T細胞鋪于6孔細胞培養板，待細胞匯合度達80%時，將上述獲得的caANP32蛋白表達質粒利用轉染試劑PEI轉染于細胞中，并分別設置pCAGGS-Flag空載體和pCAGGS-huANP32A-Flag質粒為陰性對照和陽性對照。8 h后更換細胞培養液，48 h后裂解細胞，12 000×g離心10 min后，取上清樣品加5×SDS上樣緩沖液處理后進行SDS-PAGE，按照快速濕轉儀將蛋白轉移到NC膜上，以鼠源抗Flag單克隆抗體(1∶10 000)和兔源抗β-actin單克隆抗體(1∶5 000)為一抗，DyLight80TM標記的山羊抗鼠IgG(1∶10 000)和山羊抗兔IgG(1∶5 000)為二抗，經Western blotting檢測蛋白表達。

1.2.6 氨基酸序列比對利用DNAMAN和Geneious軟件進行氨基酸序列比對。

1.2.7 caANP32家族蛋白對不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響將ANP32A/B敲除細胞系(DKO)鋪于24孔板中，恒溫培養約16 h待細胞匯合度達80%左右，分別將不同種屬的ANP32蛋白表達質粒pCAGGS-chANP32A-Flag、pCAGGS-chANP32B-Flag、pCAGGS-huANP32A-Flag、pCAGGS-huANP32B-Flag、pCAGGS-swANP32A-Flag、pCAGGS-swANP32B-Flag、pCAGGS-eqANP32A-Flag、pCAGGS-eqANP32B-Flag、pCAGGS-caANP32A-Flag、pCAGGS-caANP32B-Flag、pCAGGS-caANP32E-Flag與不同亞型流感病毒RNA聚合酶亞基和NP基因真核表達質粒(分別為來源于犬流感病毒H3N2GD11、馬流感病毒H3N8JL89和禽流感病毒H9N2ZJ12的pCAGGS-NP/PA/PB1/PB2、pEZ-vLuc和pRL-TK)共轉染DKO細胞。轉染體系如下：每孔分別加入NP(80 ng)、PA(20 ng)、PB1(40 ng)、PB2(40 ng)、vLuc(40 ng)和pRL-TK(1 ng)，當研究不同物種ANP32蛋白對聚合酶活性的影響時，在上述體系中加入ANP32真核表達質粒(20 ng)或pCAGGS-Flag空載體(20 ng),轉染24 h后棄掉細胞培養液，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書裂解細胞和取樣，利用Centro XS LB 960 Luminometer儀器檢測Firefly和Renilla的熒光值，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值即為病毒RNA聚合酶的活性。

1.2.8 統計分析試驗數據使用GraphPad Prism 7.0軟件進行分析，使用方差分析并配合Tukey檢驗共同進行組間比較，結果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 caANP32A、caANP32B和caANP32E基因mRNA的表達及其組織分布

利用實時熒光定量PCR方法對不同組織中caANP32家族基因mRNA表達水平進行定量檢測，結果顯示，在犬不同組織中均可檢測到caANP32A、caANP32B和caANP32E基因mRNA的表達，且在各組織中caANP32家族基因mRNA表達均不同，caANP32B基因mRNA表達豐度均顯著或極顯著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05；P<0.01)。caANP32A基因mRNA表達最低。在氣管、肺臟、盲腸和大腦中caANP32B基因豐度極顯著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.01)，在腎臟和脾臟中caANP32B基因豐度顯著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05)；在犬心臟中caANP32E基因組織豐度極顯著高于caANP32A基因(P<0.01)，在盲腸和大腦中caANP32E基因組織豐度顯著高于caANP32A基因(P<0.05)；在肝臟、腎臟、肺臟、腎臟和氣管中caANP32E與caANP32A基因豐度無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.2 caANP32A、caANP32B和caANP32E基因克隆和鑒定

2.2.1caANP32A、caANP32B和caANP32E基因克隆經PCR反應擴增，獲得大小分別為747、903、798、729、768和789 bp的目的條帶(圖2、3)，與caANP32A、caANP32B_X1、caANP32B_X2、caANP32B_X3、caANP32E_X1及caANP32E_X2基因大小一一對應。目的條帶經純化后連接于pCAGGS-Flag真核表達載體，進一步經測序鑒定正確，分別命名為pCAGGS-caANP32A-Flag、pCAGGS-caANP32B_X1-Flag、pCA-GGS-caANP32B_X2-Flag、pCAGGS-caANP32B_X3-Flag、pCAGGS-caANP32E_X1-Flag和 pCAGGS-caANP 32E_X2-Flag。以上結果表明caANP32家族基因在MDCK細胞和犬組織中均確切存在，且caANP32A有1種轉錄形式，caANP32B有3種轉錄形式(剪接變異體)，caANP32E有2種轉錄形式。

M，DL2000 DNA Marker;1～6，分別為caANP32A、caANP32B_X1、caANP32B_X2、caANP32B_X3、caANP32E_X1和caANP32E_X2基因。圖3同

圖3 犬心臟組織caANP32家族基因的克隆

2.2.2 caANP32A、caANP32B和caANP32E蛋白的表達經轉染和Western blotting檢測結果顯示，空載體未見陽性反應條帶，同pCAGGS-huANP32A-Flag相比，在30和40 ku之間出現與預期相符的特異性條帶，證明pCAGGS-caANP32A-Flag、pCAGGS-caANP32B_X1-Flag、pCAGGS-caANP32B_X2-Flag、pCAGGS-caANP32B_X3-Flag、pCAGGS-caANP32E_X1-Flag、pCAGGS-caANP32E_X2-Flag和pCAGGS-huANP32A-Flag蛋白在HEK293T細胞中成功獲得表達，caANP32B_X1和caANP32E_X1因分子質量較大而導致其特異性條帶稍高于其他蛋白(圖4)。

1,空載體;2～8，分別為caANP32A、caANP32B_X1、caANP32B_X2、caANP32B_X3、caANP32E_X1、caANP32E_X2和huANP32A蛋白

2.2.3 caANP32A、caANP32B和caANP32E氨基酸序列比對基于基因克隆結果發現，caANP32基因存在序列多態性。對caANP32家族蛋白氨基酸序列進行分析發現，caANP32家族基因在其亮氨酸重復區域(leucinerich repeat domain,LRR)較為保守，在低復雜酸性區域C-端區域(low-complexity acidic region,LCAR)具有較大差異。caANP32家族全長蛋白序列為：caANP32A含有249個氨基酸，caANP32B_X1氨基酸序列最長，含有301個氨基酸；caANP32B_X2次之，含有266個氨基酸；caANP32B_X3含有243個氨基酸，caANP32E_X1含有256個氨基酸，caANP32E_X2含有263個氨基酸。caANP32B的3個剪接變異體主要在N-Cap區域存在差異；而caANP32E的2個剪接變異體在N-Cap和C-Cap區域均存在較大差異，caANP32E_X1 N-端序列較長，C-端序列較短，caANP32E_X2則與之相反，即C-端氨基酸數多于N-端(圖5)。

圖5 caANP32家族氨基酸序列比對

2.3 caANP32A 對不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

以不同種屬ANP32A表達質粒與病毒RNA聚合酶共轉染DKO細胞，結果顯示,過表達caANP32A或人、豬、馬的ANP32A均可支持犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性(圖6A、6B)，即caANP32A或人、豬、馬ANP32A組犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性均極顯著高于空載體組(P<0.01)；而caANP32A對禽源流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性影響與空載體、huANP32A和eqANP32A_X2無顯著性差異(P>0.05)(圖6C)。chANP32A均極顯著支持3種亞型流感病毒RNA聚合酶活性(P<0.01)。

①A,犬流感病毒H3N2GD11;B,馬流感病毒H3N8JL89;C,禽流感病毒H9N2ZJ12。②與空載體對照組(Vec)相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4 caANP32B 對不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

以不同種屬ANP32B表達質粒與病毒RNA聚合酶共轉染DKO細胞，結果顯示，caANP32B顯著支持犬流感病毒H3N2GD11RNA聚合酶活性(P<0.05)；caANP32B顯著或極顯著支持馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性(P<0.05；P<0.01)；過表達caANP32B或人、豬、馬的ANP32B均可支持犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性(圖7A、7B)，而對禽流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性有較低的支持作用(圖7C)。chANP32B均不支持3種亞型流感病毒RNA聚合酶活性。同時，caANP32B 3個剪接變體對于犬流感病毒H3N2GD11或馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性呈現不同的支持作用，其中caANP32B_X2活性支持最高(圖7A、7B)。此外，通過對不同物種來源的ANP32B蛋白進行序列比對分析發現，caANP32B 3種剪接變異體與其他ANP32B蛋白的氨基酸相似性較高，caANP32B 3種剪接變異體主要在N-Cap區域存在序列長短和氨基酸差異(圖7D)。

A,犬流感病毒H3N2GD11;B,馬流感病毒H3N8JL89;C,禽流感病毒H9N2ZJ12;D,不同物種ANP32B的序列比對

2.5 caANP32E對不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響

以同一種屬caANP32A、caANP32B_X2和caANP32E表達質粒與病毒RNA聚合酶共轉染DKO細胞，結果顯示,過表達caANP32E_X1和caANP32E_X2對犬流感病毒H3N2GD11、馬流感病毒H3N8JL89和禽流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性影響與空載體相比均無顯著差異(P>0.05)，即caANP32E蛋白不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性(圖8A～8C)。

A,犬流感病毒H3N2GD11;B,馬流感病毒H3N8JL89;C,禽流感病毒H9N2ZJ12

3 討論

哺乳動物細胞對禽流感病毒RNA聚合酶活性具有物種限制性，是禽流感病毒跨種傳播的重要屏障之一。已有研究表明多種宿主因子可通過與 RNA 聚合酶互作調控病毒的復制及宿主適應性范圍，其中ANP32家族蛋白在A型流感病毒復制及跨物種傳播中起著決定性作用[17-18]。MDCK細胞作為一種哺乳動物細胞，常用作禽、人、馬、犬等不同物種流感病毒分離及疫苗培養的細胞系[19]，然而MDCK細胞中caANP32蛋白對不同物種流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用如何鮮有報道。本研究對犬組織和MDCK細胞中ANP32家族蛋白的多態性進行分析，明確了caANP32蛋白的表達形式，并評估了caANP32家族成員對不同物種A型流感病毒RNA聚合酶活性的影響。

犬可感染多種亞型流感病毒[20]，但僅H3N8和H3N2亞型流感病毒可在犬群中流行[21]，推測可能與不同亞型流感病毒RNA聚合酶在犬宿主細胞上的適應能力相關，而ANP32家族蛋白決定了流感病毒RNA聚合酶活性[14-15]。基于NCBI提供的預測序列信息可推測caANP32家族基因存在潛在變體，因此本研究首先對caANP32家族蛋白基因進行組織分布及序列分析。組織分布結果提示,不同組織中caANP32B豐度均極顯著高于其他2個家族成員caANP32A和caANP3E；而caANP32A和caANP32E在不同組織中的基因豐度略有不同。這可能是由于ANP32家族蛋白參與細胞發育及生命周期的多個過程[22-24]，因某些組織的生長特性導致ANP32家族基因豐度分布有所不同。犬心臟組織及MDCK細胞中ANP32家族基因克隆結果證實，caANP32家族基因存在轉錄本多態性：caANP32A存在1個轉錄本，caANP32B存在3種剪接變體，而caANP32E存在2種剪接變體。

研究發現，chANP32A基因在其LRR與LCAR區域之間具有獨特的33個氨基酸序列插入，從而能特異性支持禽流感病毒RNA聚合酶活性[11]，且chANP32A基因在其特有的33個氨基酸關鍵結構域處存在3個序列長短差異的剪接變體，而這一差異顯著影響了不同變體對流感病毒RNA聚合酶的支持活性[12,25]。本研究發現，caANP32B及caANP32E均存在不同剪接變異體，但其序列差異主要體現在N-Cap區域，并沒有類似禽ANP32A的33個氨基酸插入，這種N-Cap區域差異導致其對犬流感病毒H3N2GD11和馬流感病毒H3N8JL89RNA聚合酶活性的支持能力不同，其中caANP32B_X2支持能力顯著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3，但不改變其對禽流感病毒RNA聚合酶的支持活性。序列分析提示，caANP32B_X2的N-端序列與其他物種ANP32B序列相似性更高，而caANP32B_X1 N-端氨基酸殘基偏長，caANP32B_X3的N-端氨基酸殘基偏短，推測可能是由于caANP32B剪切變異體N-Cap區域序列長短和所編碼氨基酸差異，導致其對流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力不同。ANP32蛋白與流感病毒RNA聚合酶結合能力直接影響了其對RNA聚合酶的支持活性[15]，而caANP32B不同剪接變體的N-Cap區域序列長短差異是否影響了其與流感病毒RNA聚合酶的結合能力，仍需進一步試驗驗證。caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶的活性，也符合馬傳染病和慢病毒病創新團隊實驗室前期的研究結果[26]。此外,過表達caANP32A/caANP32B對禽流感病毒H9N2ZJ12RNA聚合酶活性支持能力均較低，表明犬和其他哺乳動物ANP32A/ANP32AB蛋白在支持哺乳動物流感病毒RNA聚合酶和禽流感病毒RNA聚合酶活性方面存在差異，表現出較強的種間限制作用。在針對不同亞型流感病毒RNA聚合酶活性分析時，陰性對照數值出現變化是由于不同亞型流感病毒RNA聚合酶的本底值不同造成的，本試驗前期對多個物種的流感RNA聚合酶分析時發現均存在這一現象，此現象不會影響單個亞型RNA聚合酶活性[14-15,26]。

禽ANP32A的3個剪接變體具有物種特異性，且禽ANP32A不同變體的豐度對禽流感病毒的進化和RNA聚合酶的適應性具有不同的驅動力[12]。ANP32蛋白的N129/130D氨基酸位點已被確認為是其支持不同物種流感病毒RNA聚合酶復制的關鍵活性位點[14]，而有研究發現部分人群中自然攜帶ANP32B D130A的突變體,該突變體可能通過競爭性與流感病毒RNA聚合酶結合從而降低攜帶人群對流感病毒的易感性[27]。本研究發現，caANP32B存在3種剪接變異體，且這3種剪接變異體對A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力不盡相同，這是否可能是驅動犬流感病毒不斷進化的內在原因仍需進一步探索。