高脂高果糖飲食對老年小鼠視網膜形態結構的影響

張玉珍，黃敏儀，陳可純，蔡永銘，楊祎琦

(廣東藥科大學，廣東省代謝病中西醫結合研究中心，廣州 510006)

隨著社會的快速發展與人們生活水平的不斷提高，以高脂高糖飲食模式為代表的高熱能膳食已成為當今普遍的飲食結構，而人口老齡化問題也日益凸顯，衰老相關疾病的發生率也逐漸增加，給家庭和社會帶來了沉重的經濟和醫療負擔[1]。2019年聯合國報告指出，到2050年全球老年人(65歲及以上)的人數將達16%[2]。研究證實，糖脂代謝異常在老年人中普遍存在，是人類心腦血管疾病重要的危險因素，也是眾多難治眼病的高危因素[3]。隨著眼病患者數量的增加，視網膜損傷已成為眼病患者視力損害的主要原因，老年眼病已成為不可忽視的群體性疾病，但目前仍缺乏系統的臨床和基礎研究[4-5]。

糖脂代謝異常引起老年視網膜病變的機制較為復雜，主要涉及晚期糖基化終產物的積累、氧化還原穩態受損、炎癥因子和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的產生及脂質代謝紊亂、氧化應激反應、細胞焦亡、內質網應激等[6-9]。研究發現，血液循環中脂質增多可引起視網膜內脂質積聚，可導致視網膜的功能減退，包括對視桿細胞、視錐細胞及雙極細胞的損傷，還可引起視網膜內核層細胞排列紊亂，視網膜色素上皮層(the retinal pigment epithelium，RPE)離斷和紊亂[10-11]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為磷酸腺苷(AMP)的活化蛋白激酶，參與體內多種代謝反應及信號通路的調控，是研究糖尿病和其他代謝相關性疾病的重要靶點[12-13]。激活的AMPK參與抑制脂質合成，其下游基因固醇調節元件結合蛋白-1(SREBP1)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化表達對促進視網膜脂質代謝發揮著重要作用[14-15]。研究表明，AMPK/SREBP/ACC信號是參與機體脂質代謝的重要通路，通過上調AMPK或抑制SREBP/ACC表達可顯著改善棕櫚酸誘導的視網膜脂質沉積及組織損傷，但在高脂高糖膳食誘導的衰老動物模型中視網膜損傷程度及機制有待進一步研究[16-18]。本研究采用高脂高果糖長期喂養C57BL/6J小鼠，通過檢測SREBP1、p-ACC、p-AMPK等脂質沉積相關蛋白表達的變化研究長期高脂高果糖飲食對老年小鼠視網膜結構的影響，以期為進一步闡明高脂高果糖飲食影響視網膜結構改變的機制提供基礎，同時為老年眼病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 12只4周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重(18±2)g，購自廣東省實驗動物中心(許可證號：44007200052789)，飼養于廣東藥科大學實驗動物中心。動物飼養期間自由飲食飲水，12 h光照和12 h黑暗交替。

1.1.2 主要試劑及儀器 組織蛋白提取液購自Thermo Scientific公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自Roche公司；BCA試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自CST公司；SREBP1一抗購自Santa Cruz Biotechnology；p-ACC、p-AMPK、β-actin一抗購自CST公司；DAPI購自Yeasen Biotechnology。組織破碎儀(TissueLyser-Ⅱ)購自QIAGEN公司；低溫高速離心機(H2050R-1)購自上海華巖設備有限公司；蛋白電泳儀購自Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統購自BioRad公司；酶標儀(Mithras LB940)購自Berthold Technologies公司；顯微鏡(BX53)購自Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組及處理 12只4周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，飼養至12月齡后，分為普通飲食組(ND)和高脂高果糖飲食組(HFHFD)，每組6只，分別給予普通飼料和高脂飼料，普通飲食組飼喂普通飼料(脂肪11.85%、蛋白質23.07%、碳水化合物65.08%)，飲用純凈水；高脂高果糖飲食組飼喂高脂飼料(72%基礎飼料+24%豬油+2.4%豆油+1.3%膽固醇+0.3%膽鹽)，飲用果糖水(12.5%)。

1.2.2 樣品采集 普通飲食組和高脂高果糖飲食組小鼠飼養至18月齡時摘取眼球，左眼球在眼球固定液中固定24 h以上備用；右眼球―80 ℃保存備用。

1.2.3 視網膜組織HE染色 取出固定的眼球組織，然后按70%乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及無水乙醇的濃度梯度脫水，用二甲苯進行透明處理后置于石蠟中進行包埋。將包埋好的組織按照4 μm厚度切片。切片常規脫蠟，依次置于無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇復水后，用超純水浸泡5 min清洗后進行HE染色，脫水后使用中性樹膠封片，過夜風干，于光學顯微鏡下觀察視網膜組織形態。

1.2.4 p-ACC免疫組化染色 取固定的眼球組織，經脫水、包埋、切片、脫蠟后，進行IHC染色，染色步驟按SABC免疫組化試劑盒操作，其中p-ACC一抗按說明書推薦稀釋濃度(1∶1 000)進行試驗。中性樹膠封片，過夜風干，于光學顯微鏡下觀察陽性染色情況并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行p-ACC表達量統計。

1.2.5 SREBP1免疫熒光 取固定的眼球組織，經脫水、包埋、切片、脫蠟后，進行抗原修復，將切片浸入TBS中，放入微波爐中加熱至沸騰，13 min后自然冷卻，用5% BSA在37 ℃封閉30 min，用SREBP1抗體(1∶250)4 ℃過夜孵育，PBS清洗后，用HRP標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，PBS清洗后用DAPI封片，于熒光顯微鏡下觀察熒光信號強度及SREBP1的分布情況，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行SREBP1表達量統計。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白的表達 取凍存的眼球組織，加入一定量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，按BCA試劑盒說明書操作，測定組織蛋白含量并定量。每組取等量蛋白上樣，采用6% SDS-PAGE分離蛋白，300 mA恒流轉膜1.5 h，TBST洗膜，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，TBST洗膜，加入一抗p-AMPK(1∶1 000)、p-ACC(1∶1 000)、SREBP1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶3 000)，常溫孵育1 h，TBST洗膜，顯影拍照，用Image Lab 4.0軟件進行蛋白條帶灰度值統計。

1.3 數據統計分析

利用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，并采用t檢驗進行組間差異比較，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 視網膜組織HE染色結果

由圖1可知，普通飲食組的視網膜結構清晰，從內到外依次可見內界膜、神經纖維層、神經節細胞層、內網狀層、內顆粒層、外網狀層、外顆粒層、視桿和視椎層、色素上皮層，各層排列緊密，界限清晰，厚度正常，細胞形態正常，未見明顯異常；高脂高果糖飲食組視網膜結構被破壞，視桿和視椎層厚度不均勻，局部增生，延伸入外顆粒層，局部變薄，外顆粒層厚度不均勻，局部增厚，且細胞排列疏松。

2.2 p-ACC免疫組化染色結果

由圖2可知，在視網膜中，p-ACC主要在神經節細胞層、內叢狀層、外叢狀層和感光細胞內段表達，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組小鼠視網膜中p-ACC的表達降低。p-ACC表達分析結果發現,與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組p-ACC蛋白表達水平顯著降低(P<0.05，圖3)。

*，差異顯著(P<0.05)。圖5、6同

2.3 SREBP1免疫熒光染色結果

由圖4可知，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組SREBP1的熒光強度增強，且外核層亦出現較大空洞，細胞核排列紊亂，各層次界限變模糊。SREBP1表達分析發現，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組SREBP1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05，圖5)。

圖4 各組視網膜組織中SREBP1的免疫熒光染色(400×)

圖5 各組視網膜組織中SREBP1的相對表達量

2.4 能量代謝樞紐信號通路蛋白表達結果

由圖6可知，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食組小鼠視網膜中p-ACC和p-AMPK蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，SREBP1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

A，各蛋白Western blotting條帶；B，各蛋白相對表達量

3 討 論

視網膜位于眼球壁的內層，內側是玻璃體，外側是脈絡膜，具有極其復雜的多層結構和大量具有微回路特征和不同功能的細胞，在視覺成像中起著至關重要的作用[19-20]。正常的視網膜結構清晰，各層次界限分明，視網膜厚度不均、增厚或變薄，細胞形態異常、排列疏松等都會導致視網膜功能損傷[21]。本研究HE染色結果顯示，高脂高果糖飲食可以使視網膜中細胞排列疏松，視桿視椎層和外顆粒層局部變薄，還可以使視桿視椎層局部增厚并延伸入外顆粒層，外顆粒層局部也有增厚，表明高脂高果糖飲食可導致視網膜功能損傷。

視網膜功能與脂質代謝密切相關，不同的脂代謝紊亂可能導致不同的視網膜病變[22-23]。如視網膜中央動脈阻塞性疾病是由高膽固醇和高甘油三酯血癥所引起，而視網膜血管內皮細胞病變主要是由血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和載脂蛋白B等升高所引起的[24]。研究發現，高脂飲食引起的代謝異常可以影響眼部血液動力，對視網膜形態和功能有著不可逆轉的損傷[25]，這與本研究結果一致，即高脂高果糖飲食可以增加脂質沉積、破壞視網膜結構形態。

ACC是脂肪酸代謝的限速酶，激活的AMPK可以促進ACC磷酸化，發揮調控脂質代謝的作用[26-27]。本研究IHC結果顯示，與普通飲食組相比，高脂高果糖組老年小鼠視網膜組織外叢狀層的p-ACC蛋白表達量顯著降低，說明高脂高果糖飲食可以改變p-ACC表達，引起視網膜外叢狀層細胞排列紊亂及外叢狀層脂質沉積。AMPK激活后可下調SREBP1表達，抑制脂肪酸合成[28-29]。SREBP1是細胞內調控脂類代謝的關鍵轉錄因子，主要調控膽固醇和脂肪酸合成中關鍵酶基因的表達[30]。本研究免疫熒光結果顯示，與普通飲食組相比，高脂高果糖飲食的老年小鼠視網膜組織中SREBP1過度表達，導致組織局部發生脂質沉積，導致外核層出現空洞。AMPK可以通過磷酸化ACC使ACC失去活性，從而抑制脂肪合成，促進脂肪酸氧化，降低脂質堆積，而高脂可增加ACC表達，p-ACC蛋白表達水平降低，脂肪合成增加，引起視網膜的損傷[31]。本研究結果顯示，與普通飲食組相比，高脂高果糖誘導的老年小鼠視網膜組織AMPK的活化顯著受到抑制，p-ACC表達降低，SREBP1表達增加，導致脂質沉積增加而損傷視網膜，提示在研究高脂高果糖喂養動物時，也要關注其眼部疾病的變化。

4 結 論

高脂高果糖飲食可降低視網膜組織中p-AMPK和p-ACC蛋白表達，增加SREBP1蛋白表達，引起脂質沉積，使視網膜各層細胞排列疏松、視網膜厚度不均勻，局部增生，導致視網膜形態結構發生改變，功能受損。結果可為研究高脂高果糖誘導的老年患者視網膜病變提供參考。