黔東南小香雞MEF2C基因外顯子多態(tài)性及其與體重、體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

2022-07-27 06:47:42蔣桂榮趙忠海陳昌雪

中國畜牧獸醫(yī) 2022年7期

周迪，敖葉，蔣桂榮，趙忠海，李俊，楊蓉，龔菲，陳昌雪，沈銀，李輝

(1.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴陽 550018；2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025；3.遵義市畜牧漁業(yè)站，遵義 563000)

據(jù)國家統(tǒng)計局官方網(wǎng)站發(fā)布的最新統(tǒng)計公報顯示，2021年全國肉類總產(chǎn)量8 887萬t，其中禽肉產(chǎn)量2 380萬t，同比增長0.8%，占肉類產(chǎn)量26.78%，僅次于豬肉59.59%的占比；禽蛋產(chǎn)量3 409萬t[1]。因此，禽類肉蛋產(chǎn)品有著良好的發(fā)展前景。通常情況下，家禽的經(jīng)濟價值主要體現(xiàn)在屠宰性能和繁殖性能，產(chǎn)肉性能則是屠宰性能的另一種表現(xiàn)形式，然而產(chǎn)肉性能又與體重、體尺性狀密不可分。肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因是MEF2基因家族一員，在肌肉沉積過程中扮演著重要角色，能夠與大多數(shù)肌肉特異基因的啟動子或增強子直接結(jié)合，從而啟動或增強相關(guān)基因的表達[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C基因發(fā)生突變，會使人群增加患2型糖尿病的風(fēng)險[4]；MEF2C基因表達異常可增加人體患急性淋巴細胞白血病的可能[5]；MEF2C基因部分或完全缺失會使機體的生長發(fā)育嚴重遲緩[6]；MEF2C基因與南江黃山羊的生長發(fā)育具有密切關(guān)系[7]；MFE2C基因可通過結(jié)合肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)啟動子的相關(guān)位點來調(diào)節(jié)肌纖維類型相互轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)對肌肉的正常生長及發(fā)育調(diào)控[8]；MSTN基因啟動子與MEF2C基因同時參與了牛肌肉生長和分化的調(diào)控[9]；MEF2C基因5′-UTR變異可導(dǎo)致機體功能缺失從而出現(xiàn)嚴重的發(fā)育障礙[10]。然而目前關(guān)于MEF2C基因的研究主要集中在人類醫(yī)學(xué)以及其他模式生物和大型家畜上，對于雞的研究鮮見報道。黔東南小香雞是貴州省獨有的地方家禽品種，具有耐粗飼、抗逆性強、肉質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，但由于群體數(shù)量偏少，加之缺少科學(xué)的選育方案，群體近交頻繁，導(dǎo)致黔東南小香雞近交衰退現(xiàn)象日趨明顯[11-13]。鑒于此，本研究以黔東南小香雞為研究對象，選取MEF2C為候選基因，通過篩選試驗群體中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，并與黔東南小香雞的體重、體尺指標進行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得具有遺傳價值的標記位點，為黔東南小香雞保種、育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

300日齡健康黔東南小香雞由貴州省榕江縣小香雞保種場提供，其中母雞146只、公雞105只，自由飲水和采食，翅靜脈采血，EDTA抗凝，冰盒帶回實驗室，―20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ后w體重、體尺指標測量按照《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法》(NY/T 823―2004)進行。

血液基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMasterMix、DL2000 DNA Marker、GoldView Ⅰ型核酸染料均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2 基因組DNA提取

采用血液基因組DNA提取試劑盒對血樣進行DNA提取，利用微量紫外分光光度計進行DNA純度和濃度檢測，鑒定合格的樣品于―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中雞MEF2C基因預(yù)測序列(登錄號:NC_052572.1)，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計20對特異性引物用于擴增MEF2C基因全部外顯子區(qū)域，引物信息見表1。引物均由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR擴增及測序

PCR反應(yīng)體系30 μL：2×TaqMasterMix 15 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電壓130 V，時間20 min。對鑒定合格的PCR擴增產(chǎn)物送往安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進行直接測序，測序結(jié)果利用DNAStar程序進行比對，并用GenBank上公布的參考序列(登錄號：NC_052572.1)進行校正。

1.5 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010對生長數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，利用SPSS 18.0軟件中一般線性模型(GLM)、非配對等方差t檢驗方法對不同SNPs位點各基因型與雞的體重、體尺性狀進行關(guān)聯(lián)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物檢測

利用20對特異性引物擴增MEF2C基因全部外顯子區(qū)域，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物長度與預(yù)期大小一致，條帶清晰明亮，可進行下一步試驗，部分結(jié)果見圖1。

M，DL2000 DNA Marker；1～3，MEF2C-18引物PCR擴增結(jié)果；4～6，MEF2C-19引物PCR擴增結(jié)果；7～9，MEF2C-20引物PCR擴增結(jié)果

2.2 SNP位點分析

利用DNAStar程序?qū)y序結(jié)果進行比對，結(jié)果在黔東南小香雞MEF2C基因外顯子12中發(fā)現(xiàn)3個SNPs，在第1 819 bp處發(fā)生T→C突變，命名為g.1819 T>C，導(dǎo)致第607位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，存在3種基因型：TT、CC、TC(圖2A)；在第2 426 bp處發(fā)生T→C突變，命名為g.2426 T>C，導(dǎo)致第809位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，存在2種基因型：TT和CC(圖2B)；在第2 543 bp處發(fā)生C→T突變，命名為g.2543 C>T，導(dǎo)致第848位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，存在2種基因型：TT和CC(圖2C)。

A，g.1819 T>C；B,g.2426 T>C；C,g.2543 C>T

2.3 遺傳學(xué)分析

由表2可知，g.1819 T>C、g.2426 T>C和g.2543 C>T位點的優(yōu)勢基因型分別為CC、CC和TT，優(yōu)勢等位基因分別為C、C和T；χ2檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個SNPs位點在黔東南小香雞群體中均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 MEF2C基因SNPs位點基因型頻率及基因頻率

2.4 MEF2C基因多態(tài)性與黔東南小香雞體重、體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，g.1819 T>C位點TC基因型個體體斜長、胸深和脛圍均極顯著高于TT和CC基因型(P<0.01)，CC基因型個體胸深和脛圍顯著高于TT基因型個體(P<0.05)；TC基因型個體體重極顯著高于TT基因型(P<0.01)，顯著高于CC基因型(P<0.05)；TC基因型個體脛長顯著高于TT和CC基因型(P<0.05)，TT和CC基因型之間差異不顯著(P>0.05)；TC基因型龍骨長顯著高于TT基因型(P<0.05)，與CC基因型差異不顯著(P>0.05)。g.2426 T>C位點TT基因型個體脛圍極顯著高于CC基因型(P<0.01)，其余性狀指標在兩種基因型間差異均不顯著(P>0.05)。g.2543 C>T位點CC基因型個體脛圍極顯著高于TT基因型(P<0.01)，其余性狀指標在兩種基因型間差異均不顯著(P>0.05)。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，g.2426 T>C和g.2543 C>T位點互為連鎖平衡位點。

表3 MEF2C基因多態(tài)性與黔東南小香雞體重、體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

MEF2C基因是一個廣譜表達基因，在動物機體的多個組織中均能檢測到表達，尤其是肌肉組織中[14]。王琴[15]研究報道，MEF2C基因在山羊多個組織中均能檢測到表達，且存在4種不同的轉(zhuǎn)錄本。邱進等[16]研究指出，MEF2C基因啟動子區(qū)多態(tài)性造成人獲得性先天性心臟病的可能性增大。楊華婷等[17]研究報道，興義鴨MEF2C基因啟動子區(qū)的突變可能會使轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合位點發(fā)生改變，從而導(dǎo)致屠宰性狀受到影響；興義鴨MEF2C基因存在2種可變剪切體，且在腿肌和胸肌中的表達量不隨日齡的增加而升高[18-19]。展召陽[20]研究顯示，MEF2C基因多態(tài)性對黃牛的體重、體長、體高、胸圍、坐骨端寬等多個性狀存在顯著影響。沈并兵[21]研究報道，在南江黃羊MEF2C基因多個外顯子中存在多個SNPs位點，且對山羊生長性狀有顯著影響。因此，無論是MEF2C基因的啟動子區(qū)還是其他區(qū)域的突變，都對動物機體存在著一定的影響。本研究利用PCR擴增技術(shù)獲得了黔東南小香雞MEF2C基因全部外顯子序列，并從中發(fā)現(xiàn)了3個SNPs，與體重、體尺性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，g.1819 T>C位點TC基因型對黔東南小香雞的體重及體尺性狀多個指標存在極顯著或顯著影響，而g.2426 T>C和g.2543 C>T位點僅對脛圍有極顯著影響，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果有一定的相似性，說明MEF2C基因多態(tài)性確實對黔東南小香雞體重、體尺指標有影響，這3個SNPs可以作為黔東南小香雞輔助選育參考位點，尤其是g.1819 T>C位點。

趙忠海[22]研究報道，在興義鴨MEF2C基因中存在多個突變位點，但未詳細介紹這些突變位點所在的具體外顯子。王興東等[23]研究報道，牦牛MEF2C基因與普通牛相比存在2個堿基變異和一段24 bp缺失，且2個堿基變異均引起了所編碼氨基酸的改變。Juszczuk-Kubiak等[24]對不同牛品種的MEF2C基因多態(tài)位點進行篩選時，僅在啟動子及內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)5個SNPs位點。展召陽[20]研究報道，在秦川牛、郟縣紅牛、德南牛和夏郟牛4個黃牛品種中均僅在MEF2C基因內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)4個SNPs位點。師新彩[25]在興義鴨MEF2C基因的外顯子中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點。本研究中，僅在黔東南小香雞外顯子12中發(fā)現(xiàn)3個SNPs，其余外顯子中均未發(fā)現(xiàn)，推測MEF2C基因外顯子區(qū)域的保守性較強；通過χ2檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個SNPs位點均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，這可能是人為過度干預(yù)黔東南小香雞品種選育，導(dǎo)致品種間長期頻繁近交，造成群體間遺傳距離較近，進而種間樣本數(shù)量較小，也有可能是黔東南小香雞在獨特的生長環(huán)境中經(jīng)過自然選擇進化的結(jié)果。但無論是哪種原因所致，加強對地方品種的保護、開發(fā)和研究顯得尤為重要，今后本課題組將進一步圍繞黔東南小香雞核心主產(chǎn)區(qū)，加大樣本量進行深入研究，進一步豐富黔東南小香雞MEF2C基因研究成果，為該品種的保護、開發(fā)和利用提供理論支撐。