miR-140-5p對前脂肪細胞3T3-L1成脂分化的機制研究

原佳慧，張鵬翔，吉樹森，盧嘉茵，羅小毛，閆 藝，王海東

(山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801)

肌內脂肪是反映動物肉品質的重要指標，其含量直接影響動物肉的風味、嫩度、多汁性及大理石花紋的分布[1]。脂肪組織是動物體內重要的分泌組織，脂肪細胞會分泌瘦素、脂聯素等[2-3]。哺乳動物脂肪組織主要分為白色脂肪組織、棕色脂肪組織和米色脂肪組織。3種脂肪組織來源不同，功能也各不相同。白色脂肪組織內含有較多的甘油三酯，可以儲存機體多余的能量。由于白色脂肪細胞中線粒體含量較低，所以其雖儲存能量能力較強，但脂肪消耗能量的能力較差[4-5]。因此，脂肪干細胞的形成及代謝過程的直接或間接調控因子已成為研究熱點。

多種miRNA可直接或間接參與脂肪細胞分化的轉錄與翻譯過程，且其可通過與下游靶基因結合的方式參與調控脂肪干細胞的分化及發育[6]。研究表明，內源性miR-140-5p在小鼠骨髓基質細胞(ST2)分化過程中表達較高，miR-140-5p可靶向轉化生長因子β受體Ⅰ(TGFBR1)調節脂肪細胞分化[7]，miR-140-5p能夠靶向且正調控長鏈非編碼RNA 核副斑點裝配轉錄物1(LnoRNA NEAT1)促進脂肪衍生干細胞(ADSCs)成脂分化[8]。此外，研究表明，CCAAT增強子結合蛋白家族(C/EBPs)與miR-140-5p的近端啟動子結合正調控miR-140-5p的表達[7]，表明miR-140-5p與C/EBPs可能是正反饋模式，miR-140-5p可能在脂肪分化過程中發揮著重要的作用。通過查找miRBase等網站發現了可能靶向miR-140-5p的基因，一部分已經被驗證參與脂肪干細胞的分化過程，其中P300/CBP相關因子(PCAF)又名KAT2B，是組蛋白乙酰轉移酶，具有乙酰轉移活性，能通過乙酰化組蛋白和非組蛋白的方式參與基因的轉錄調控[9]。P300/CBP與細胞周期調控、細胞凋亡和癌癥的發生有著直接的關系[10]。研究表明，PCAF基因在3T3-L1細胞成脂分化過程中具有重要作用[11]，同時關于PCAF基因在成脂分化方面相關文獻較少，PCAF基因影響成脂分化的具體機制還不清晰。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員。PPAR可分為α、β(或δ)和γ 3種類型，其中PPARγ主要表達于脂肪組織及免疫系統，與脂肪細胞分化、機體免疫及胰島素抵抗關系密切，是一種可由多種脂肪酸及其衍生物激活的核轉錄因子[12]。PPARγ參與脂肪細胞分化，并與肥胖密切相關，是公認的脂肪分化的標志因子[13]。C/EBPs家族是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族，具有多種功能，在細胞增殖、分化、信號傳導、腫瘤發生及機體的免疫、應激反應、能量代謝、血液生成等方面發揮著重要的作用[14-15]。目前發現的C/EBPs家族有C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPζ 6類，且C/EBPs家族是第一個被證明在脂肪細胞分化過程中起重要作用的家族[16]。研究表明，在前脂肪細胞3T3-L1分化過程中C/EBPβ的表達在脂肪分化初期瞬時增強，而后C/EBPα與PPARγ轉錄激活[17]。基于PPARs與C/EBPs家族互相影響且在細胞成脂分化中起到重要的作用，本試驗選擇C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ作為3T3-L1細胞成脂分化機制的下游基因進行深入研究，探索miR-140-5p對3T3-L1細胞成脂分化的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

高糖DMEM購自上海帝博思生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自Sciencell公司；Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910購自Abcam公司；Lipofectamine?2000轉染試劑、質粒中提試劑盒均購自Thermo公司；PGLO載體、PGLO-PCAF 3′-UTR載體、PEGFP-N1載體、PEGFP-N1-PCAF載體均購自武漢淼靈生物科技有限公司；RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR?Primix ExTaqⅡ均購自TaKaRa公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、Adipogenesis Assay試劑盒均購自Abcam公司；PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ抗體購自Proteintech Group公司；限制性內切酶XhoⅠ、KpnⅠ、NheⅠ均購自NEB公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自深圳康體生命科技有限公司。

1.2 分子材料的設計及合成

1.2.1 miR-140-5p模擬物、抑制物的合成 根據miRBase網站miR-140-5p全序列(登錄號：KT921569.1)，由吉瑪基因公司設計并合成miR-140-5p的模擬物、抑制物及對照序列(miR-140-5p mimics、inhibitor、NC)(表1)。

表1 模擬物、抑制物及siRNA信息

1.2.2 siRNA設計及合成 根據GenBank中PCAF基因完整CDS區序列(登錄號：NM_001190846.1)，由吉瑪基因公司設計并合成PCAF基因的3條siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)(表1)。

1.2.3 載體構建 根據GenBank中PCAF基因完整CDS區序列(登錄號：NM_001190846.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設計PCAF過表達引物，以3T3-L1細胞cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL：cDNA 5 μL，2×TaqMasterMix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環；72 ℃終延伸5 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收，與PEGFP-N1空載體同時使用限制性內切酶XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切，將二者雙酶切產物連接，連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，對轉化后的大腸桿菌進行搖菌、涂板、挑單克隆菌、搖菌，將得到的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序成功后對菌液進行質粒提取，重組質粒命名為PEGFP-N1-PCAF。

根據miRDB網站得到PCAF基因的3′-UTR序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計PCAF 3′-UTR引物(表2)，其中包含miR-140-5p與PCAF基因預測結合位點，使用上述方法構建PGLO-PCAF 3′-UTR載體。

1.2.4 引物設計及合成 根據miRBase、GenBank中miR-140-5p、PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物，引物信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 引物信息

1.3 miR-140-5p對3T3-L1細胞成脂分化的影響

1.3.1 3T3-L1細胞轉染及分化 3T3-L1細胞解凍后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，按照2×105/mL接種到6孔板中，待匯合度達到70%左右時進行細胞轉染。用250 μL DMEM培養基(不含血清和雙抗)分別稀釋miR-140-5p mimics(mimics)、NC和Lipofectamine?2000轉染試劑，室溫靜置5 min，將NC與miR-140-5p mimics分別與轉染試劑混勻后靜置20 min；靜置期間，將6孔板里的舊培養基棄掉，用PBS清洗細胞2次，加入800 μL新鮮DMEM培養基(不含血清和雙抗)；靜置結束后將500 μL轉染混合液均勻滴加到培養板中，輕輕晃動培養板使溶液混合均勻；培養箱中靜置6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養基(不含雙抗)繼續培養。待細胞匯合度達70%時進行誘導分化，將完全培養基換為誘導培養基(將胰島素、IBMX、地塞米松試劑按照說明書1 000倍稀釋，1 mL完全培養基加入1 μL各試劑配制誘導培養基)，誘導3 d后換為分化培養基(將胰島素試劑按照說明書1 000倍稀釋，1 mL完全培養基加入1 μL配制分化培養基)繼續培養，2 d換1次分化液。

1.3.2 油紅O染色鑒定 在誘導分化第7天進行油紅O染色。將3T3-L1細胞每孔加入100 μL稀釋的脂滴分析固定劑，并孵育15 min；用100 μL洗滌液洗2次，每次5 min；干燥培養板；將75 μL油紅O工作液添加到所有孔中，包括不含細胞的空白孔，并孵育20 min；移除所有油紅O溶液，用蒸餾水清洗細胞數次，至蒸餾水清澈；用100 μL洗滌液洗2次，每次5 min。顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測基因的表達 在誘導分化的第―1(分化前1 d)、0、1、2、3、5、7天收集3T3-L1細胞，用于實時熒光定量PCR檢測miR-140-5p mRNA相對表達量；在誘導分化第7天收集細胞進行C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ mRNA相對表達量檢測。用TRIzol提取誘導分化第―1、0、1、2、3、5、7天的3T3-L1細胞、轉染miR-140-5p mimics和NC組誘導分化7 d的3T3-L1細胞總RNA并反轉錄合成cDNA。PCR反應體系10 μL：2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 200 ng，ddH2O補足10 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環；72 ℃延伸5 min。

1.4 miR-140-5p靶基因篩選及靶基因序列保守性分析

采用miRandn(http:∥mirdb.org/)和TargetScan(http:∥www.targetscan.org/vert_70/)2個miRNA數據庫預測miR-140-5p的靶基因，在數據庫中挑選與脂肪分化相關的靶基因作為潛在靶基因。通過在miRBase(https:∥www.mirbase.org/)數據庫得到小鼠、人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、大鼠、兔子、豬、牛、貓、犬、棕蝠、大象、負鼠、金剛鸚鵡和雞的miR-140-5p及其靶基因結合位點序列，通過比對各物種miRNA序列，分析其結合位點序列的保守性。

1.5 miR-140-5p對其預測靶基因表達的影響

1.5.1 3T3-L1細胞培養、細胞轉染及細胞分化 將miR-140-5p mimics(mimics)、miR-140-5p inhibitor(inhibitor)與NC按照1.3.1方法轉染到3T3-L1細胞中，細胞培養與誘導分化方式同1.3.1。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測靶基因的表達 在誘導的第2天收集1.5.1各組細胞進行實時熒光定量PCR。試驗方法同1.3.3，檢測mimics、inhibitor與mimics NC組的miR-140-5p的靶基因mRNA相對表達水平。

1.5.3 Western blotting檢測蛋白的表達 在誘導的第2天收集1.5.1各組細胞進行Western blotting檢測。用蛋白裂解液收集mimics、inhibitor與mimics NC組的細胞后，冰上裂解40 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清液，檢測蛋白濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，經過轉膜、室溫封閉1 h、孵育一抗(4 ℃孵育過夜)、洗膜、孵育二抗(37 ℃孵育1 h)、洗膜后，涂抹發光液后在凝膠成像系統中曝光。檢測miR-140-5p靶基因的蛋白表達水平。

1.6 過表達或敲低PCAF對3T3-L1細胞成脂分化的影響

1.6.1 3T3-L1細胞培養、細胞轉染及細胞分化 將PEGFP-N1-PCAF載體、PEGFP-N1載體、NC、PCAF siRNA1、PCAF siRNA2和PCAF siRNA3、PCAF NC與PCAF siRNA3按照1.3.1的方法轉染到3T3-L1細胞，細胞培養與誘導分化方式同1.3.1。在誘導第2天時收集各組細胞進行實時熒光定量PCR和Western blotting檢測，在誘導分化第7天進行油紅O染色鑒定。

1.6.2 油紅O染色 試驗方法同1.3.2，觀察PEGFP-N1-PCAF與PEGFP-N1組及PCAF siRNA與NC組細胞中脂滴的染色情況。

1.6.3 實時熒光定量PCR檢測基因的表達 試驗方法同1.3.3，檢測PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1組細胞PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因的相對表達水平；檢測PCAF siRNA、NC組PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因的相對表達水平。

1.6.4 Western blotting檢測蛋白的表達 試驗方法同1.5.3，檢測PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1組細胞C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ與GAPDH蛋白表達水平；檢測PCAF siRNA1、PCAF siRNA2、PCAF siRNA3和NC組細胞中PCAF蛋白表達水平；檢測PCAF siRNA組與NC組C/EBPβ、PPARγ與GAPDH蛋白表達水平。

1.7 miR-140-5p與PCAF靶向關系驗證

將293T細胞分為mimics+PCAF 3′-UTR、NC+PCAF 3′-UTR、mimics+PGLO空載(mimics+vehicle)和空白+PCAF 3′-UTR(Blank+3′-UTR PCAF)4組，待293T細胞匯合度達到70%～80%進行轉染，用125 μL DMEM培養基(不含血清和雙抗)分別稀釋PCAF 3′-UTR質粒、mimics，用250 μL DMEM培養基稀釋Lipo2000轉染試劑(6 μL/孔)，室溫靜置5 min，將質粒和mimics與轉染試劑分別混勻再靜置20 min，按照1.3.1的方法進行轉染，培養72 h后收集細胞，用于雙熒光素酶報告試驗檢測。試驗前需按照Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910試劑盒說明書制備裂解液1×PLB、LAR Ⅱ、Stop & Glo試劑、1×Stop & Glo Raegent。除去培養基，用PBS清洗細胞后，將1×PLB加入到培養孔中。在室溫輕緩晃動培養板15 min，將裂解液轉移到檢測板中，加入20 μL PLB裂解液/孔，加入100 μL LAR Ⅱ，檢測樣本熒火蟲熒光素酶活性；加入100 μL Stop & Glo試劑，檢測樣本海腎熒光素酶活性。

1.8 數據統計分析

用2-△△Ct法計算各基因相對表達量，采用ImageJ 1.48軟件計算蛋白灰度值，用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 miR-140-5p對3T3-L1細胞成脂分化的影響

在3T3-L1細胞分化過程中，miR-140-5p的表達量有明顯變化趨勢。與誘導分化前1 d(-1 d)相比，在細胞匯合至100%時miR-140-5p表達水平極顯著上升(P<0.01)，在添加誘導培養基第1天時，miR-140-5p表達水平極顯著上升(P<0.01)，而后在分化過程中下降，分化至第3天miR-140-5p表達水平顯著上升(P<0.05)，分化至第5天后miR-140-5p表達水平已降低到未分化之前的水平(圖1A)。油紅O染色發現，mimics組脂滴明顯多于NC組(圖1B)。與NC組相比，mimics組成脂標志性基因C/EBPδ、PPARγ轉錄水平極顯著升高(P<0.01)，C/EBPβ基因的轉錄水平有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)(圖1C～1E)。

①A，3T3-L1細胞分化第-1、0、1、2、3、5、7天miR-140-5p表達水平；B，miR-140-5p NC組與mimics組油紅O染色結果(40×)；C～E，C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ mRNA相對表達量。②與―1 d相比，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01)；無#，差異不顯著(P>0.05)。③與NC/PEGFP-N1組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 miR-140-5p靶基因預測及PCAF序列保守性分析

利用TargetScan網站預測發現，miR-140-5p與PCAF 3′-UTR區含有預測結合位點，在674-681 bp處(圖2A)。預測結合位點在小鼠、人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、大鼠、兔子、豬、牛、貓、犬、棕蝠、大象、負鼠、金剛鸚鵡和雞物種間的保守性比對發現，在不同物種間此結合位點保守性較高(圖2B)。

A，miR-140-5p和PCAF 3′-UTR區的預測結合位點；B，PCAF 3′-UTR區序列保守性分析

2.3 miR-140-5p對PCAF表達的影響

由圖3可知，與NC組相比，mimics組miR-140-5p、PCAF的表達量均極顯著增加(P<0.01)，inhibitor組miR-140-5p的表達量極顯著降低(P<0.01)、PCAF的表達量顯著降低(P<0.05)。由圖4可知，與NC組相比，mimics組PCAF蛋白的表達量顯著增加(P<0.05)，inhibitor組PCAF蛋白的表達量無顯著變化(P>0.05)。

圖3 各組miR-140-5p(A)與PCAF(B)基因的相對表達量

圖4 各組PCAF蛋白表達量

2.4 過表達PCAF對3T3-L1細胞成脂分化的影響

由圖5可知，與PEGFP-N1組相比，PEGFP-N1-PCAF組細胞脂滴明顯增加。由圖6可知，與PEGFP-N1組相比，PCAF、PPARγ基因相對表達量均極顯著增加(P<0.01)，C/EBPδ基因相對表達量有上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。由圖7可知，與PEGFP-N1組相比，PEGFP-N1-PCAF組C/EBPβ、C/EBPδ蛋白表達水平極顯著上升(P<0.01)，PPARγ蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。

圖5 油紅O染色結果(40×)

圖6 各組PCAF(A)、C/EBPδ(B)和PPARγ(C)基因相對表達量

A，C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ蛋白Western blotting條帶；B～D，C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ蛋白灰度值

2.5 敲低PCAF基因對3T3-L1細胞成脂分化的影響

由圖8可知，與NC組相比，3條siRNA均極顯著抑制PCAF蛋白的表達水平(P<0.01)，由于siRNA3組PCAF蛋白水平降低最顯著，所以選用siRNA3進行后續PCAF敲低試驗。由圖9可知，siRNA3組脂滴明顯少于NC照組。與NC組相比，siRNA3組C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ基因相對表達量均極顯著下降(P<0.01)(圖10)；與NC組相比，siRNA3組C/EBPβ蛋白表達水平極顯著降低(P<0.01)，PPARγ蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)(圖11)。

A、B，在3T3-L1細胞中分別轉染3條PCAF siRNA后PCAF蛋白的表達水平

圖9 油紅O染色結果(40×)

2.5 miR-140-5p與PCAF基因靶向關系驗證

雙熒光素酶報告試驗結果顯示，與Blank+PCAF 3′-UTR、mimics+vehicle和NC+PCAF 3′-UTR相比較，mimics+PCAF 3′-UTR組中雙熒光素酶活性均無顯著差異(P>0.05)(圖12)，說明miR-140-5p與PCAF基因無靶標關系。

圖12 各組雙熒光素酶相對活性

3 討 論

脂肪代謝及分化與動物的生長發育息息相關，miRNA在脂肪分化過程中的作用與功能具有重要意義。研究表明，在ST2細胞成脂分化過程中，在細胞匯合至100%的第2天添加誘導分化液，miR-140-5p的表達水平在誘導分化前1 d升高，在誘導分化后第1天達到最高值[7]。本研究在細胞匯合至100%當天添加誘導分化液，結果顯示，3T3-L1細胞在誘導分化當天miR-140-5p表達水平極顯著升高，在誘導后第1天miR-140-5p表達量達到峰值，與ST2細胞的研究結果基本一致。其原因可能在于：當細胞匯合100%時，3T3-L1細胞達到了細胞接觸抑制時期，這時期為前體脂肪細胞分化第一階段(克隆增殖階段)，且細胞在接觸抑制后很快進入第二階段(終末分化階段)，為了避免錯過分化第一階段，所以本研究中誘導分化時間選擇在這一時期。但本試驗結果顯示，在誘導分化后第1天miR-140-5p水平達到峰值，與上述文獻一致，這個峰值可能代表著細胞進入了分化的第二階段，而造成細胞分化第一階段到第二階段的原因可能是添加誘導分化試劑引起的。miR-140-5p在細胞分化第一階段與第二階段均顯著增高，這說明miR-140-5p在3T3-L1細胞分化過程中扮演重要角色。本研究通過過表達miR-140-5p，發現miR-140-5p能夠促進3T3-L1細胞的成脂分化，并且上調成脂分化相關基因PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ的表達。

為了探究miR-140-5p的成脂調控作用，利用TargetScan與miRBase等靶基因預測網站預測miR-140-5p的下游靶基因，從中選擇與脂肪分化相關的PCAF基因作為研究對象。有研究表明，PCAF基因在3T3-L1細胞分化中發揮重要作用[11]。本研究結果證明，與NC組相比，miR-140-5p mimics組PCAF基因的表達量上調，miR-140-5p inhibitor組PCAF基因表達量下降，說明miR-140-5p可影響PCAF基因的表達。與轉染空載體對照組相比，PCAF基因高表達后脂滴明顯增多，且C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ的轉錄與蛋白表達水平均上升；相反，敲低PCAF抑制3T3-L1細胞分化為脂滴，且C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ的轉錄與蛋白表達水平均不同程度地下降，說明PCAF是通過正調控C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ基因促進3T3-L1細胞成脂分化的。盡管組蛋白乙酰化對脂肪細胞分化調控的研究較少，但目前的文章顯示組蛋白乙酰化修飾水平與成脂分化水平呈正相關[18]。Jin等[19]研究發現，PCAF通過調節PPARγ的表達來促進脂肪的發生，并通過影響Prdm16的表達來調節棕色脂肪的發生。除此之外，C/EBPβ轉錄活性也受PCAF的調節，PCAF可促進前脂肪細胞中C/EBPβ乙酰化[20]，且增強前脂肪細胞分化過程中C/EBPα的轉錄激活，從而提高分化效率[21]。以上結果說明，PCAF在細胞分化過程中的功能是通過調控PPARγ與C/EBPs來實現的，由此可得，miR-140-5p可通過miR-140-5p/PCAF/C/EBPs、PPARγ促進細胞成脂分化。

由于miR-140-5p和PCAF的正相關關系與miRNA對靶基因的調控作用機制不一致，PCAF 3′-UTR與miR-140-5p的預測結合位點序列比對結果顯示，其預測結合位點在多物種間序列保守性較高，但雙熒光素酶試驗驗證結果卻顯示二者并無靶標關系。因此，miR-140-5p可能是通過靶向其他基因間接影響了PCAF的表達，但具體通路并不清晰。利用TargetScan與miRBase等預測靶基因的網站，預測miR-140-5p的其他靶基因，其中一些靶基因可能在miR-140-5p與PCAF基因之間具有一些作用，如E3泛素蛋白連接酶-1(siah E3 ubiquitin protein ligase 1，Siah1)、E3泛素蛋白連接酶UBR5(ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5，UBR5)、組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)、組蛋白脫乙酰酶7(histone deacetylase7，HDAC7)等基因。Siah1是一種泛素連接酶，通過降解蛋白調節細胞內蛋白平衡，且是miR-140-5p的預測靶基因，如若Siah1可泛素化PCAF使其降解，而miR-140-5p又成功靶向且負調控Siah1，這時Siah1就具有了在miR-140-5p與PCAF之間發揮作用的潛質。而UBR5也是泛素蛋白連接酶之一，可能與Siah1具有類似功能。HDAC4和HDAC7是組蛋白脫乙酰酶，其作用與組蛋白乙酰轉移酶PCAF相反，且在細胞核內組蛋白乙酰化與組蛋白去乙酰化過程處于動態平衡，并由這2種酶共同調控。miR-140-5p的預測靶基因中有HDAC4和HDAC7，所以miR-140-5p極有可能通過負調控HDAC4或HDAC7的表達而間接影響了PCAF基因的表達。

4 結 論

本研究結果發現，內源性miR-140-5p在成脂分化的克隆增殖階段與終末分化階段都明顯升高，miR-140-5p通過上調PCAF的表達促進PPARγ和C/EBPs表達而促進前脂肪細胞成脂分化。雙熒光素酶試驗結果顯示，miR-140-5p與PCAF之間無靶標關系，說明miR-140-5p可能通過間接作用于PCAF而促進前脂肪細胞的分化。