復合添加劑對解凍后奶牛性控凍精質量及受胎率的影響

許曉玲，白佳樺，肖霖力，秦玉圣，宋玉清，劉 彥

(北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097)

奶牛性控凍精可以按照實際生產需求繁育出更多的優良母牛，是良種快速擴繁的重要技術手段。特別是近年來隨著分離技術的發展，性控精液X精子分離準確率為85%～95%[1]。人工授精后性控母犢率高達95.45%，與普通凍精47.37%的母犢率相比，優勢特別明顯[2]。但是，在性控凍精制作過程中需要對精液進行稀釋、染色、流式分離、冷凍等體外操作，導致其在凍融后的精子活力、頂體完整率及受精率等重要指標方面顯著低于常規冷凍精液[3]。同時，性控凍精普遍存在輸精后受胎率不高的問題，因此限制了該項技術在奶牛特別是經產奶牛生產中的推廣應用。

褪黑素(melatonin)是一種主要由松果體分泌的神經內分泌激素，其在生物節律、生殖、免疫、抗氧化等方面發揮著重要作用。多項研究表明，在冷凍精液稀釋液中添加褪黑素可以顯著提高解凍后精子活力、動力學相關參數[4-5]以及精子頂體膜、質膜的完整性[6]。前列腺素(prostaglandin，PGF2α)是存在于動物和人體中的一類由不飽和脂肪酸組成的、具有多種生理作用的活性物質，最早是在人精液中發現的，主要來自精囊；此后發現其存在于動物體睪丸、子宮、胎盤及卵巢等多種組織。研究表明，在人工授精前1～2 h，用輸精管吸入2 mL PGF2α注射到子宮頸分叉處，可以提高奶牛輸精后的受胎率[7]；在解凍后精液中添加1.5 mg/mL PGF2α也可顯著提高奶牛的受胎率[8]。但褪黑素和前列腺素兩者組合后對解凍后奶牛性控凍精的作用鮮見報道。鑒于此，本研究開展了以褪黑素、地諾前列腺素為主的精液復合添加劑對性控凍精解凍后精子活率、運動參數、頂體完整性、高能線粒體比例及受胎率的影響，以期為提高奶牛場良種覆蓋率提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

褪黑素、碘化丙啶(PI)、Hochest 33342、FITC-PNA均購自Sigma公司；JC-1試劑盒購自Invitrogen公司；Steridyl?精液稀釋液購自Minitube公司；地諾前列腺素(dinoprostin)購自輝瑞公司。

用于精液品質分析的牛性控凍精購自北京首農畜牧發展有限公司奶牛中心(308H017803、308H016683、11109693)；用于牛場輸精試驗所用性控凍精購自荷蘭CRV奶牛育種公司(151HO03369、551HO03416)。

1.2 試驗處理

從液氮中取出30支0.25 mL奶牛性控凍精細管，分為2組：試驗組和對照組，每組15支，37 ℃水浴鍋中解凍30 s。剪開細管封口，將精液加入到37 ℃預熱的250 μL精液復合添加劑(試驗組)或250 μL精液稀釋液(對照組)EP管中，混勻。將混合物室溫孵育0、2和4 h后，用于后續精液品質檢測試驗。試驗組中褪黑素和地諾前列腺素的終濃度分別為24 ng/mL和1.5 mg/mL。

1.3 精液品質測定

1.3.1 性控凍精活率 取孵育后的性控凍精混合物100 μL，添加5 μL PI和5 μL Hochest 33342置于37 ℃水浴鍋避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于熒光顯微鏡下觀察，統計視野里的死精子數(紅色)和總精子數(藍色)，計算精子活率。每個樣品取5個視野計算平均值。計算公式為：

精子活率(%)=(總精子數―死精子數)/總精子數×100%

1.3.2 精子頂體完整性 取孵育后的性控凍精混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μL Hochest 33342及10 μL FITC-PNA，置于37 ℃水浴鍋避光孵育30 min。取出10 μL制片，置于熒光顯微鏡下觀察，統計視野里的死精子數(紅色)和總精子數(藍色)，以及發生頂體反應或頂體破損精子數(綠色)，計算活精子中沒有頂體反應的精子數占總精子數的比例。每個樣品取5個視野計算平均值。計算公式為：

頂體完整率(%)=(總精子數-染綠色精子數-染紅色精子數)/總精子數×100%

1.3.3 精子高能線粒體活性 取孵育后的性控凍精混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μL Hochest 33342及10 μL JC-1，置于37 ℃水浴鍋避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于熒光顯微鏡下觀察，統計高能線粒體(紅色)的精子數占總精子數的比例。每個樣品取5個視野計算平均值。

1.4 人工授精試驗

從液氮中取出多支0.25 mL奶牛性控凍精細管，迅速置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍30 s，將37 ℃預熱的復合添加劑(試驗組)或精液稀釋液(對照組)按照1∶1的比例添加到解凍后的性控精液中，用于發情周期正常的216頭青年母牛(對照組101頭、試驗組115頭)及子宮環境良好的82頭頭胎母牛(對照組26頭、試驗組56頭)輸精。輸精時間嚴格控制在排卵前的3～5 h內進行。同時，通過直腸把握確定優勢卵泡位置，采用子宮體深部輸精，輸精28 d后采用血檢確定妊娠情況。

1.5 統計分析

試驗數據應用SPSS 25.0統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 復合添加劑對性控凍精精子品質的影響

2.1.1 復合添加劑對性控凍精活率的影響 通過對復合添加劑孵育0、2及4 h后的性控凍精進行PI和Hochest 33342 染色，染色情況見圖1，其中PI染紅色代表死精子，Hochest 33342染藍色代表總精子。由表1可知，孵育0 h，試驗組及對照組性控凍精活率分別為45.82%和44.68%，差異不顯著(P>0.05)；孵育2 h，試驗組性控凍精活率為39.03%，顯著高于對照組(P<0.05)；孵育4 h，試驗組及對照組性控凍精活率分別為21.19%和20.17%，差異不顯著(P>0.05)。

圖1 精子活率檢測(400×)

表1 奶牛性控凍精經復合添加劑孵育后不同時間的精子活率

2.1.2 復合添加劑對性控凍精頂體完整性的影響 對復合添加劑孵育0、2及4 h后的精子頂體完整性進行檢測，染色結果見圖2，其中FITC-PNA染綠色代表發生頂體反應或頂體破損的精子，PI染紅色代表死精子，Hochest 33342染藍色代表總精子。由表2可知，孵育0 h，試驗組和對照組精子頂體完整性分別為48.92%和48.31%，差異不顯著(P>0.05)；孵育2 h，試驗組精子頂體完整率為38.91%，顯著高于對照組(P<0.05)；孵育4 h，試驗組和對照組精子頂體完整性分別為26.62%和24.95%，差異不顯著(P>0.05)。

圖2 精子頂體完整性檢測(400×)

表2 奶牛性控凍精經復合添加劑孵育后不同時間的頂體完整率

2.1.3 復合添加劑對性控凍精線粒體活性的影響 通過對復合添加劑孵育0、2及4 h后的精子線粒體活性進行染色，染色結果見圖3，JC-1染紅色代表高能線粒體精子，Hochest 33342染藍色代表總精子。由表3可知，孵育0 h，試驗組精液中高能線粒體活性精子比率為35.20%，與對照組間差異不顯著(P>0.05)；孵育2和4 h，試驗組精液中高能線粒體活性精子比率分別為32.76%和24.90%，均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 精子線粒體活性染色(400×)

表3 奶牛性控凍精經復合添加劑孵育后不同時間的高能線粒體活性精子比率

2.2 復合添加劑對奶牛性控凍精受胎率的影響

將37 ℃預熱的復合添加劑按照1∶1的比例添加到解凍后的性控精液中，分別用于青年奶牛和頭胎奶牛的輸精試驗，輸精后28 d采血進行早期妊娠診斷確定配種受胎情況，結果見表4。由表4可知，試驗組青年奶牛和頭胎奶牛受胎率分別為65.22%和48.21%，均顯著高于對照組(P<0.05)。

表4 奶牛性控凍精添加復合添加劑后的受胎率

3 討 論

3.1 復合添加劑對奶牛性控凍精品質的影響

奶牛性控凍精可根據牛場發展的需求較短時間內獲得更多的優良母犢后代，從而實現養殖利潤的最大化。隨著流式細胞分離技術的不斷發展，性控精子分離效率和準確率都在不斷提高，生產成本也在不斷降低。但由于性控凍精受精能力遠低于常規凍精，因此在一定程度上限制了其在生產中的推廣應用。研究表明，性控凍精受精能力低與其制備分選時染料、附加電荷、分離壓力、高度稀釋、冷凍、長時間體外操作等引起氧化應激產生大量活性氧(ROS)有關，大量的ROS改變了精子結構功能，使精子出現DNA片段化、脂質過氧化、頂體完整性與活力降低[9]，從而抑制了精子受精能力[10-13]。針對以上問題，不少研究者通過在精液冷凍保護液液中添加維生素、谷胱甘肽、半胱氨酸、海藻糖、褪黑素、槲皮素、白藜蘆醇等抗氧化物來緩解冷凍精液的氧化損傷，效果顯著。孫偉[14]研究表明，通過添加抗氧化劑(VE、SOD、CAT)可以明顯提升奶牛分離X精子的活力和體外存活時間。但這些研究主要集中在冷凍保護劑中，在性控凍精分選中及分選后的研究相對較少。Li等[15]研究表明，在水牛精液中補充10-4mol/L褪黑素可以有效減少性控精液分選和凍融過程產生ROS引起的氧化損傷；褪黑素在精子冷凍中的作用機制可能是通過改變激酶的活性從而降低了精子的冷凍損傷[16-17]。Li等[18]研究表明，褪黑素主要是通過抑制凋亡和MT1受體來促進牛性控凍精的受精能力。Pang等[19]在解凍后的奶牛常規精液中添加10-5和10-3mol/L褪黑素可以顯著增加精子頂體完整性、線粒體活性，顯著降低胞內ROS水平。這與本試驗在性控精液中的研究結果是一致的。本研究通過對解凍后性控凍精添加以褪黑素和地諾前列腺素為主的復合添加劑孵育2 h后，精子活率、頂體完整性、高能線粒體活性精子比率均顯著增加。因此，復合添加劑中褪黑素作為強氧化劑，在精液冷凍、精液分選及精液解凍后都具有提高其活力、減少氧化應激的作用，為提高輸精后的受胎率奠定了基礎。

3.2 復合添加劑對性控凍精受胎率的影響

性控凍精解凍后存活時間短，輸精后受胎率也比普通凍精低。因此，在生產實踐中性控凍精的推廣使用受到了一定限制，特別是在經產母牛中很少使用。與常規精液人工授精相比，性控凍精人工授精情期受胎率可降低15%～20%[20]。青年奶牛第1次使用性控凍精配種妊娠率為41.11%(761/1 851)，返情牛第2次配種妊娠率為36.52%(42/115)[21]。不同研究表明，用性控精液給奶牛進行人工授精后青年牛的受胎率顯著高于經產母牛。吳洪等[22]研究表明，青年牛和成母牛性控凍精受胎率分別為55.60%(93/167)和48.20%(198/411)，兩者差異顯著。本研究中，青年奶牛的受胎率高于頭胎奶牛，且復合添加劑組青年奶牛和頭胎奶牛的受胎率分別為65.22%和48.21%，均顯著高于對照組。復合添加劑主要成分是褪黑素和地諾前列腺素，褪黑素可以直接參與卵泡的發育與排卵，提高牛卵母細胞成熟率及胚胎的發育率[23-24]；在配種同時體外注射10-3～10-1mol/L褪黑素可以有效提高奶牛受胎率[25]。此外，在解凍后凍精及輸精前的子宮頸中添加PGF2α均可提高奶牛的受胎率[7-8]。因此，復合添加劑促進性控凍精的受胎率不僅是因為減少了性控凍精的氧化損傷，提高凍精在生殖道的運動能力，還可能是因為促進了卵泡的及時排卵，增加了精卵結合的機會。

4 結 論

以褪黑素和地諾前列腺素為主的精液復合添加劑能夠提高解凍后奶牛性控凍精的精子活率、頂體完整率、高能線粒體活性精子比率以及輸精后的受胎率。