miR-449b對綿羊早期胚胎發育的影響

任秀美奧，姚旭東，蒙亞琦，郭延華，唐 紅，張譯元，趙興旺，王立民，周 平

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆農墾科學院，省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，石河子 832000；3.石河子總場農業服務發展中心，石河子 832000)

在自然受精過程中，精子除提供單倍體基因組外，還提供精源性RNA(核糖核酸)并參與早期胚胎的發育調控[1]，精源性RNA的含量很少，但對受精、早期胚胎發育以及表觀遺傳等均發揮重要調控作用[2]。微小核糖核酸(miRNA)是大小為20～25 nt的單鏈非編碼 RNA，占脊椎動物基因的1%～3%，約超過30%的基因被其調控[3]。精源性信使核糖核酸(mRNA)和miRNA對胚胎轉錄和基因表達有重要作用[4]。Wang等[5]發現miR-449b在牛精子中高表達，提示miR-449b進入卵母細胞中參與受精后胚胎的發育，同時miR-449b在受精卵重編程過程中發揮著重要作用。對小鼠生殖細胞研究發現，miR-449簇與miR-34b/c在調節小鼠睪丸組織發育過程中具有協同作用[6]。對牛體細胞核移植的供體細胞轉染精源性miR-449b，通過靶向組蛋白去乙?；?(HDAC1)的表達，提高核移植2-細胞和8-細胞胚胎的組蛋白H3K9乙酰化水平，促進表觀重編程[5]。以上研究表明，在胚胎發育過程中精源性miR-449b調節因子具有重要作用。羊睪丸組織高通量測序顯示，miR-449b在羊睪丸組組中表達[7]。H3K9三甲基化(H3K9me3)依賴性異染色質是早期胚胎發育過程中的主要障礙之一[8]，參與早期胚胎基因調控和印跡X失活過程[9-11]。編碼H3K9me3相關染色質因子的基因缺失會導致基因無法正常表達和胚胎致死[12-13]。Yuan等[14]和Conine等[15]在缺乏精子RNA的早期胚胎中未發現基因組甲基化異常，但Wang等[8]對小鼠早期胚胎中H3K9me3修飾的全基因組研究發現，H3K9me3在啟動子和長末端重復序列(LTR)中表現出明顯的動態特征，受精后母系基因組與父系基因組都進行大規模的H3K9me3重建,且H3K9me3能在原核期胚胎的雌原核和2-細胞期胚胎中檢測到。目前關于miR-449b對早期胚胎組蛋白H3K9me3影響的研究鮮見報道。本試驗通過比較綿羊成纖維細胞、成熟卵母細胞與精子中miR-449b的含量，探索miR-449b的表達情況，通過顯微注射法為孤雌胚胎補充正常受精過程中帶入的miR-449b，同時使用免疫熒光染色觀察補充miR-449b對綿羊2-細胞期孤雌胚胎組蛋白H3K9me3的影響，研究miR-449b對綿羊早期胚胎組蛋白甲基化的影響，為綿羊早期胚胎發育機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 于石河子屠宰場采集綿羊卵巢；在新疆農墾科學院綿羊新種質資源培育基地采集1月齡純種薩?？斯?3只)的耳組織，以及3歲左右純種薩?？斯?5只)的精液。綿羊卵巢保存于加雙抗的37 ℃生理鹽水中2 h內運回實驗室。采集的耳組織放入含雙抗的0.9%生理鹽水中，與采集的新鮮精液一起，常溫下2 h內運送回實驗室。

1.1.2 主要試劑及儀器 TRIzol購自Invitrogen公司；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、無水乙醇、細胞培養液均購自TaKaRa公司；PBS緩沖液購自Biological Industries公司；卵母細胞成熟液、胚胎培養液、顯微操作液、受精液、氯仿、Percoll、DEPC、二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、4，6-二脒基-2-苯基吲哚二月桂酸酯(DAPI)、透明質酸酶、石蠟油均購自Sigma公司；RNase-free水購自天根生化科技(北京)有限公司；4%多聚甲醛、透膜液、封閉液、清洗液均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗H3K9me3抗體、山羊抗兔IgG均購自Abcam公司；實時熒光定量PCR儀(LightCycler 480 Ⅱ)購自Roch公司；梯度PCR儀(Labcycler 48)購自SensoQuest公司；超凈工作臺(VS-840垂直流)購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；CO2培養箱(Galaxy 48R)、顯微注射儀(Femtojet)、顯微操作系統(Transfer Man 4r)均購自Eppendorf公司；拉針儀(PC-100)、斷針儀(MF-830)、生物顯微鏡(SMZ800)、激光共聚焦顯微鏡(Stellaris 5)均購自Nikon公司。

1.1.3 miR-449b模擬物及其對照的設計與合成 根據miRBase中提供的miR-449b-5p的序列(登錄號：MIMAT0036232)設計miR-449b的模擬物(miR-449b mimic)及其模擬物對照(NC mimic)序列，miR-449b mimic：5′-AGGCAGUGUAUUGUU-AGCUGGC-3′，NC mimic：5′-UCACAACCUCCU-AGAAAGAGUAGA-3′。序列由上海吉熒生物技術有限公司合成。將miR-449b mimic與NC mimic粉末溶解并稀釋成20 μmol/L，―80 ℃保存備用。

1.2 精子、成熟卵母細胞與成纖維細胞的獲取

1.2.1 精子 將5只羊的精液混合后，用Percoll密度梯度離心法純化精子，在10 mL尖底離心玻璃管底部加入2 mL 90% Percoll離心液，在其上方傾斜緩慢加入45% Percoll離心液，將200 μL精液緩慢加入離心管中45% Percoll密度梯度離心液表面，2 000 r/min離心10 min，離心后玻璃離心管尖底有云霧狀精子，將離心管上層與中下層的渾濁液體和死、弱精子輕輕吸走，留少量底部精子和液體，用200 μL鈍化槍頭將精子吸走，加入37 ℃預熱的1 mL PBS液中，1 500 r/min離心5 min，將上清液盡可能吸掉，留精子沉淀用于精子RNA的提取。

1.2.2 成熟卵母細胞 用剪刀除去多余結締組織，用生理鹽水清洗3次至無血液和異物。用刀片刺破直徑為2～8 mm的卵泡，體視鏡下挑選包裹2～3層顆粒細胞的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，用采卵液清洗2遍，放入卵母細胞成熟液進行體外培養，38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養16～18 h。將成熟卵母細胞用0.1%透明質酸酶消化，脫去顆粒細胞，顯微鏡下挑選胞質均勻的卵母細胞備用。

1.2.3 成纖維細胞 在培養皿內將耳組織剪碎至大小約0.1 cm3的小塊，按0.5 cm間距接種于培養皿中，待組織貼壁后，加細胞培養液，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。每2～3 d換1次液，當組織塊周圍爬出的細胞生長至80%～90%時進行傳代培養。

1.3 精子、成熟卵母細胞與成纖維細胞中miR-449b的表達

1.3.1 精子、成熟卵母細胞與成纖維細胞RNA的提取 按照TRIzol試劑說明書提取綿羊精子RNA，―80 ℃保存備用。以50個胚胎為1組，使用GenEluteTM單細胞RNA純化試劑盒，按步驟提取成熟卵母細胞RNA，―80 ℃保存備用。待成纖維細胞鋪滿10 cm培養皿的90%左右，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS清洗2～3次，加入1 mL TRIzol裂解液后按照步驟提取總RNA，―80 ℃保存備用。

1.3.2 精子、成熟卵母細胞與成纖維細胞RNA的反轉錄 將精子、成熟卵母細胞與成纖維細胞的RNA按照Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit說明書進行反轉錄。反轉錄體系10 μL：mRQ Buffer(2×)5 μL，RNA 3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL。反應程序：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min，反轉錄所得cDNA立即進行實時熒光定量PCR或―80 ℃保存備用。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測miR-449b的表達 根據GenBank中綿羊miR-449b序列(登錄號：MIMAT0036232)用miRNA RT Primer軟件設計miR-449b正向引物F:GGGAGGCAGTGTAT-TGTTAGCTG，反向通用引物與U6內參引物由Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit提供。PCR反應體系20 μL：SYBR Green Ⅰ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性50 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸20 s，共45個循環。熔解曲線：95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。

1.4 孤雌激活胚胎制備

卵母細胞成熟后，用0.1%透明質酸酶消化，脫去顆粒細胞，顯微鏡下挑選胞質均勻的卵母細胞轉移至提前準備好的注射微滴中，用固定針固定卵母細胞，視野下調至透明帶與注射針尖清晰可見，將0.9%生理鹽水(對照組，Con)、NC mimic、miR-449b mimic分別注射進胞質中，以均勻擴散為標準，迅速撤出注射針。將注射后的卵母細胞在成熟液中恢復0.5～1 h，去除死亡的卵母細胞，剩余卵母細胞進行孤雌激活，激活步驟如下：將注射后的卵母細胞移至7%無水乙醇中激活8 min；用發育液清洗2次，再放入6-DMAP中激活4 h，用發育液清洗2次，放入發育液微滴中，在38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，觀察并拍照，收集2-細胞胚胎，第2、7天分別統計卵裂率和囊胚率。

1.5 IVF胚胎制備

將綿羊精子按照1.2.1方法處理，最后獲得活力>80%的精子，將精子稀釋成1×106～5×106/mL，在培養箱中平衡2 h，將帶有少量顆粒細胞的卵母細胞置于受精液滴中并加入精子，于38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中進行IVF；受精18 h后將卵母細胞轉入胚胎發育液中，在38.5 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中進行體外培養，收集2-細胞胚胎用于H3K9me3免疫熒光染色。

1.6 胚胎H3K9me3免疫熒光染色

收集IVF 2-細胞胚胎及Con、NC mimic和miR-449b mimic組2-細胞胚胎，用0.1% PVA洗3次,用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min，然后將固定好的胚胎放入透膜液中，孵育30 min后用封閉液封閉1～2 h，用0.1% PVA清洗3次，將4種類型胚胎與兔抗H3K9me3抗體(1∶500 稀釋)一抗4 ℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次5 min，與山羊抗兔IgG(1∶100)二抗室溫共孵育2 h，用PBS清洗3次，每次5 min，再用DAPI復染5～8 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ 1.48對H3K9me3進行熒光強度分析。

1.7 數據統計分析

實時熒光定量RCR結果用2-ΔΔCt法進行計算。H3K9me3免疫熒光強度用ImageJ 1.48軟件進行統計。用GraphPad Prism 6.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用Bonferroni法進行比較。結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 綿羊精子純化與卵母細胞培養

新鮮綿羊精液經Percoll密度梯度離心純化后所得精子形態正常，活力為85%(圖1A)；綿羊成熟COCs顆粒細胞擴散良好，卵母細胞胞質均勻(圖1B);綿羊耳組織培養3 d后周圍有梭形細胞爬出，體外培養具有貼壁生長特性(圖1C)。

圖1 綿羊精子(A)、成熟卵母細胞(B)與成纖維細胞(C)形態(40×)

2.2 miR-449b在綿羊成纖維細胞、成熟卵母細胞與精子中的表達

由圖2可知，miR-449b在精子中的表達顯著高于成熟卵母細胞和成纖維細胞(P<0.05)，成熟卵母細胞與成纖維細胞中miR-449b的表達差異不顯著(P>0.05)。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4同

2.3 各組胚胎的卵裂率與囊胚率

由表2、圖3可知，與Con組相比，miR-449b mimic和NC mimic組卵裂率均顯著降低(P<0.05)，且NC mimic組卵裂率顯著低于miR-449b mimic組(P<0.05)；miR-449b mimic組囊胚率提高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 各組胚胎發育情況(40×)

表2 各組胚胎的卵裂率與囊胚率

2.4 各組2-細胞胚胎中H3K9me3表達量的變化

由圖4A可知，IVF、Con、NC mimic與miR-449b mimic組2-細胞胚胎均表達組蛋白H3K9me3，且都在細胞核表達。由圖4B可知，與Con組相比，NC mimic組2-細胞胚胎組蛋白H3K9me3的表達水平顯著增加(P<0.05)，miR-449b mimic組2-細胞胚胎組蛋白H3K9me3的表達水平顯著降低(P<0.05)；miR-449b mimic組2-細胞胚胎組蛋白H3K9me3顯著低于NC mimic組(P<0.05)，且與IVF組無顯著差異(P>0.05)。

A，各組2-細胞胚胎中組蛋白H3K9me3的免疫熒光檢測(40×)；B，組蛋白H3K9me3的相對熒光強度

3 討 論

成熟精子是攜帶最少細胞質、高度特化壓縮的細胞，不發生復制、轉錄或翻譯[2]，且含有少量mRNA、miRNA、內源性小干擾RNA(endo-siRNA)和piwi相互作用RNA(piRNA)[16-17]。采用單精子顯微注射(ICSI)將部分缺失miRNA和endo-siRNA的精子與正常卵母細胞受精，所得胚胎發育能力明顯降低，當補充正常精子總RNA或small RNA后胚胎發育能力與卵胞漿內ICSI胚胎移植后的出生率得到提高，表明精子miRNA和endo-siRNA對正常胚胎發育至關重要[14]。miRNA能結合靶基因mRNA的3′-UTR區域，降低靶基因mRNA轉錄后水平，調控基因表達從而影響細胞的分化、增殖、代謝等多個過程[18-19]。miR-449簇包括miR-449a、miR-449b、miR-449c、miR-449d，其中miR-449b具有組織特異性表達，在睪丸中高表達，其許多靶基因在生物學過程中發揮重要作用[20]。本試驗對比綿羊成纖維細胞、成熟卵母細胞與精子中miR-449b的相對表達，結果表明miR-449b在精子中高表達，這與Wang等[5]結果一致，提示精子miR-449b參與胚胎的早期發育。

關于miRNA對早期胚胎發育的相關研究越來越多，包括在小鼠精子中高表達的miR-34c，其可以調控DNA的合成[21]，說明miR-34c對小鼠胚胎的第一次卵裂至關重要。牛體外受精胚胎桑椹胚和囊胚階段高表達miR-130b，抑制miR-130b的表達顯著降低桑椹胚和囊胚的形成[22]。牛精子攜帶的miR-202b抑制靶基因胞裂蛋白7(SEPT7)的表達,調節紡錘體的形成和細胞骨架的穩定性，從而延緩體細胞核移植胚胎的第一次分裂[23]。Wang等[5]通過制備牛體細胞核移植胚胎模型研究miR-449b的作用，結果顯示，miR-449b可延遲牛植入前克隆胚胎的第一次卵裂時間、促進表觀遺傳重編程和降低凋亡指數。為探究miR-449b對綿羊早期胚胎的作用，本試驗將miR-449b mimic顯微注射至綿羊成熟卵母細胞，結果發現miR-449b mimic組孤雌激活胚胎卵裂率比NC mimic組明顯提高，miR-449b mimic組孤雌激活胚胎囊胚率提高但不顯著。說明miR-449b在綿羊早期胚胎卵裂率與囊胚形成方面發揮重要作用，綿羊miRNA參與早期胚胎發育過程。

基因組在胚胎發育早期被廣泛去甲基化對胚胎正常發育至關重要，在發育過程中必須經過調控才能保持基因組穩定性[24]。其中組蛋白甲基化是影響核重編程效率的主要因素之一，且組蛋白甲基化比組蛋白乙?；揎椄訌碗s，其中H3氨基端的K4和K9作為組蛋白甲基化的多發位點，組蛋白甲基化轉移酶催化H3K4和H3K9位點進行單甲基化、二甲基化和三甲基化水平的改變[25]。本試驗利用免疫熒光染色檢測對成熟卵母細胞補充miR-449b后組蛋白H3K9me3水平的改變，結果表明miR-449b能降低綿羊早期胚胎中組蛋白H3K9me3的表達水平。小鼠上的研究發現，正常受精后H3K9me3異染色質重編程清除啟動子區域H3K9me3的障礙，為合子基因組激活建立不受限制的表觀遺傳環境，這可能是胚胎達到全能性狀態所必需的[26]。在早期胚胎發育過程中，H3K9me3標記的基因相對較少且穩定，而大部分LTRs逐漸被H3K9me3依賴性異染色質標記，2-細胞胚胎特異性LTRs的表達水平是提高細胞發育潛能的標志[27-28]，一些逆轉錄轉座子上H3K9me3水平的增加與LTRs在2-細胞階段后的沉默有關[8]。本試驗結果發現，組蛋白H3K9me3在miR-449b mimic組2-細胞胚胎顯著低于NC mimic與對照組胚胎，其表達水平與體外受精胚胎相似，表明miR-449b參與早期胚胎發育過程中組蛋白甲基化重編程。

4 結 論

miR-449b在綿羊精子中高表達，且能顯著提高綿羊早期胚胎的發育率，降低早期胚胎中組蛋白H3K9me3的表達水平，表明miR-449b在早期胚胎發育過程中發揮重要作用，為進一步探索早期胚胎發育的分子機制提供參考。