2-氨基乙基聯苯基硼酸酯對玻璃化冷凍牛成熟卵母細胞發育能力的影響

莫顯紅，岳凱平，孫麗瑤，李 冰，趙 冰，郭 成，徐振軍

(赤峰學院化學與生命科學學院，赤峰 024000)

哺乳動物卵母細胞超低溫冷凍保存對于保護動物種質資源、加快優良品種繁育、拯救瀕危動物等具有重要意義[1]。然而，玻璃化冷凍卵母細胞發育能力降低，制約了該項技術的擴大應用，提高冷凍效率一直是低溫生物學領域研究的熱點。Ca2+作為細胞內普遍存在的第二信使，參與調控卵母細胞成熟分裂、激活及早期胚胎發育等過程[2]。但在脅迫條件下，如卵母細胞體外操作和體外培養過程中暴露于高氧環境或使用過氧化氫(H2O2)處理，產生的氧化應激可以引起胞內游離Ca2+([Ca2+]i)濃度異常升高，即鈣穩態失衡[3]。研究證實，玻璃化冷凍作為一種應激因素，也會引起卵母細胞[Ca2+]i濃度異常增加，使得皮質顆粒(CG)提前釋放、透明帶硬化，導致受精率降低[4-6]。然而，玻璃化冷凍引起胞內[Ca2+]i濃度升高的具體機制尚未闡明。

胞內[Ca2+]i濃度升高有2個來源，一個是胞外Ca2+的內流，另一個是胞內鈣庫Ca2+釋放[7]。胞內[Ca2+]i濃度降低也通過這2條途徑實現[8]。在小鼠、綿羊、牛的卵母細胞玻璃化冷凍保存中，使用無Ca2+或低Ca2+冷凍保護劑均可提高卵母細胞的存活率和發育能力[9-11]。研究表明，在玻璃化冷凍液中添加鈣螯合劑1,2-雙(2-氨基苯氧基)-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸(BAPTA)[11]、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)[12]可降低胞內[Ca2+]i含量，從而顯著提高冷凍卵母細胞解凍后的發育能力。研究發現，2-氨基乙基聯苯基硼酸酯(2-APB)作為IP3受體(IP3Rs)抑制劑，降低IP3Rs敏感性，可抑制吲哚美辛[13]、順鉑[14]等藥物誘導的內質網中Ca2+釋放，從而抑制細胞凋亡。薛玉環[15]使用2-APB預處理小鼠卵母細胞后進行冷凍，一定程度上降低了胞內Ca2+濃度，減少細胞損傷，提高卵母細胞的發育能力。本實驗室前期試驗結果表明，在綿羊卵母細胞體外成熟培養液中添加10 μmol/L 2-APB可有效阻止卵母細胞免受氧化應激損傷，提高了綿羊體外成熟卵母細胞的質量[16]。本研究以無Ca2+玻璃化冷凍液冷凍成熟培養24 h的牛卵母細胞，冷凍前用10 μmol/L 2-APB預處理10 min，檢測其對冷凍后卵母細胞成活率和發育能力的影響，以期為探討冷凍保存導致鈣穩態失衡的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢 試驗所用牛卵巢來自河北省廊坊市大廠回族自治縣屠宰場，采集的牛卵巢置于含雙抗的35 ℃生理鹽水中，2～4 h內運回實驗室。

1.1.2 主要試劑及儀器 DPBS和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；2-APB(D9754)、FITC-PNA(L7381)、聚蔗糖(Ficoll 70000)、SOF液、非必需氨基酸(NEAA)、必需氨基酸(EAA)、表皮生長因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)均購自Sigma公司。體視顯微鏡(Z61)、熒光顯微鏡(BX51)均購自Olympus公司；激光共聚焦顯微鏡(EZ-C1)購自Nikon公司；CO2培養箱(3110)購自Thermo公司。

1.1.3 試劑與溶液配制 ①抽卵液：TCM199+5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+0.01 g/L肝素鈉+10 mL/L FBS+0.065 g/L青霉素+0.05 g/L鏈霉素。②成熟培養液：TCM199+10% FBS+0.02 IU/mL FSH+ 0.02 IU/mL LH+1 μg/mL E2+1 mmol/LL-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF。③mPBS液：DPBS(Gibco)100 mL，添加0.0036 g丙酮酸鈉、0.1 g葡糖糖、0.3 g BSA。④FS液：300 g/L聚蔗糖添加0.5 mol/L蔗糖，經mPBS溶解后配制而成。⑤玻璃化冷凍液(VS)及解凍液(TS)：VS1：基礎液為mPBS，含7.5%乙二醇(EG)+7.5%二甲基亞砜(DMSO)+20% FBS；VS2：基礎液為FS，含15% EG+15% DMSO+20% FBS；TS1：基礎液為mPBS，含1 mol/L蔗糖；TS2：基礎液為mPBS，含0.5 mol/L蔗糖；TS3：基礎液為mPBS，含0.25 mol/L蔗糖。⑥胚胎發育液：SOF+1% NEAA+1% EAA+10 ng/mL EGF+1 mmol/LL-谷氨酰胺+8 mg/mL BSA。⑦2-APB濃儲液：取適量2-APB溶解在甲醇中配成1 000倍濃儲，分裝，于―20 ℃儲存，臨用前用成熟培養液稀釋至10 μmol/L。

1.2 卵母細胞的采集及成熟培養

用帶有18號針頭的10 mL注射器(先吸取2 mL抽卵液)抽吸卵巢表面3～8 mm的卵泡，于體視顯微鏡下挑選包裹3層及以上卵丘顆粒細胞、胞質均勻的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)放于體外成熟培養液中，在38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養24 h。

1.3 卵母細胞玻璃化冷凍-解凍

用0.1%透明質酸酶消化體外成熟培養24 h的COCs脫去卵丘顆粒細胞，得到牛MⅡ卵母細胞，隨機分成對照組(直接進行玻璃化冷凍保存)和2-APB組(玻璃化冷凍前用10 μmol/L 2-APB處理10 min)。牛MⅡ卵母細胞在室溫條件下采用開放式拉長塑料細管(OPS)法進行玻璃化冷凍。將牛MⅡ卵母細胞(5枚為宜)在VS1液中平衡30 s，移入VS2液中滲透25 s，將牛MⅡ卵母細胞及少量VS2液吸入OPS中，并立即投入液氮。2 d后，將OPS從液氮中取出，迅速將牛MⅡ卵母細胞排至TS1液中。MⅡ卵母細胞在TS1液中平衡1 min后移入TS2液中保持5 min；移入TS3液中保持5 min；將MⅡ卵母細胞移入成熟液中，于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中恢復培養2 h。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 卵母細胞存活率 統計1.3解凍后0 h及恢復培養2 h時的牛MⅡ卵母細胞的存活率。卵母細胞活力的判定標準：卵母細胞的形態正常，無變形；胞質均勻，沒有明顯的胞漿溢出與皺縮，透明帶與卵黃膜完整可見，卵周隙清晰。在體視顯微鏡下可見存活卵母細胞的卵黃膜折光性好，胞質呈黑灰色；而死亡卵母細胞沒有折光性，胞質呈均質的土黃色。

1.4.2 皮質顆粒分布 取1.3冷凍-解凍恢復培養2 h的對照組及2-APB組牛MⅡ卵母細胞，用0.5%鏈酶蛋白酶消化去除透明帶，用3.7%多聚甲醛室溫固定30 min，在封閉液(DPBS+0.3% BSA+ 100 mmol/L 甘氨酸)中洗3次，用0.1% Triton X-100滲透5 min。在封閉液中洗3次，每次5 min，卵母細胞與10 μmol/L FITC-PNA室溫下共孵育30 min，在mPBS中洗3次，每次5 min。染色壓片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3 卵母細胞活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量 取1.3冷凍-解凍恢復培養2 h的對照組及2-APB組牛MⅡ卵母細胞，在含有1 mmol/L 2′,7′-DCHFDA的DPBS微滴中孵育20 min，用mPBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發光為460 nm。用10 μmol/L Cell Tracker Blue CMF2HC孵育牛MⅡ卵母細胞20 min標記胞內GSH，用mPBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發光為370 nm。用EZ-C1軟件分析ROS和GSH熒光強度值。

1.4.4 卵母細胞發育能力 取1.3冷凍-解凍恢復培養2 h的對照組及2-APB組牛MⅡ卵母細胞，用成熟24 h未冷凍的卵母細胞作為新鮮對照組(Fresh組)，進行孤雌激活，檢測各組卵母細胞的發育能力。將各組卵母細胞放入含有7%乙醇的成熟培養液中激活5 min，再放入2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)液中于38.8 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養4～6 h。充分洗滌后放入孤雌胚胎發育液中繼續培養。孤雌激活當天記為第0天，激活后第2、7 d分別統計卵裂率和囊胚率。

1.5 數據統計分析

用SPSS 16.0 軟件進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan氏法進行組間多重比較。結果以平均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 2-APB預處理對冷凍-解凍牛卵母細胞存活率的影響

由圖1可知，與對照組相比，2-APB組冷凍-解凍后牛卵母細胞解凍后(0 h)和恢復培養2 h的存活率均顯著增加(P<0.05)(圖1)。

*，差異顯著(P<0.05)。圖3同

2.2 2-APB對冷凍卵母細胞皮質顆粒分布的影響

由表1、圖2可知，與對照組相比，2-APB組皮質顆粒在皮質區的分布比例顯著提高(P<0.05)，皮質顆粒在胞質內彌散分布比例顯著降低(P<0.05)；皮質顆粒部分釋放和完全釋放的比例在2組間無顯著差異(P>0.05)。

A，皮質區分布：皮質顆粒在質膜下皮質外圍呈單層環形；B，部分釋放：皮質顆粒在質膜下皮質外圍分布，但不連續；C，彌散分布：皮質顆粒聚集成形狀不規則的小團，彌散分布在胞質中；D，完全釋放：在皮質區幾乎觀察不到皮質顆粒

表1 各組冷凍卵母細胞皮質顆粒的分布比例

2.3 2-APB對冷凍卵母細胞ROS和GSH含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，2-APB組胞內ROS水平顯著降低(P<0.05)，2-APB組胞質內GSH含量顯著升高(P<0.05)。

圖3 各組牛卵母細胞內ROS和GSH的相對含量

2.4 2-APB對冷凍后卵母細胞孤雌激活發育能力的影響

由表2可知，與Fresh組相比，對照組卵母細胞孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率均顯著降低(P<0.05)；與對照組相比，2-APB組孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率均顯著提高(P<0.05)，且2-APB組與Fresh組無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組冷凍卵母細胞孤雌激活的發育潛力

3 討 論

Ca2+作為第二信使在細胞信號轉導過程中發揮重要作用，參與調節許多生命過程，因此細胞內嚴格的鈣穩態調控對維持細胞正常生命活動至關重要。胞內持續的[Ca2+]i濃度升高，可激活磷脂酶、蛋白酶和核酸內切酶，造成細胞生物膜系統、細胞骨架系統及遺傳物質系統受損，導致細胞損傷甚至凋亡[17]。研究報道，玻璃化冷凍降低了卵母細胞的存活率和發育能力，這一現象與冷凍過程中低溫或抗凍保護劑(如DMSO、EG)引起胞內[Ca2+]i異常升高有關[9]。為了提高冷凍保存效率，研究者去除冷凍液中的Ca2+并加入Ca2+螯合劑BAPTA，降低胞內[Ca2+]i濃度，可顯著提高冷凍卵母細胞的發育能力[11,18]，這與本研究結果一致。本試驗在不含Ca2+的冷凍液中玻璃化冷凍保存卵母細胞，冷凍前采用2-APB處理可顯著提高解凍后的存活率和孤雌胚胎的發育能力。

哺乳動物卵母細胞皮質顆粒的正確分布與卵母細胞質量和后期胚胎發育能力密切相關[19]。研究報道，牛[19]、小鼠[20]、豬[21-22]、綿羊[23]MⅡ期卵母細胞的皮質顆粒在皮質區呈單層環形分布。受精時卵母細胞激活，皮質顆粒內容物從卵母細胞的皮質釋放到卵周隙，使皮質顆粒在皮質外圍的單層環形分布消失，透明帶硬化，對阻止多精入卵具有重要作用[24]。這種使卵母細胞激活、發生皮質反應的機制與胞內[Ca2+]i濃度升高息息相關[25]。研究發現，玻璃化冷凍保存MⅡ期卵母細胞常發生皮質顆粒提前釋放的異常現象[26]，導致透明帶硬化，影響受精效果[27]。分析其機制發現，玻璃化冷凍液中的DMSO和EG均可引起胞內[Ca2+]i濃度升高，并與受精時[Ca2+]i濃度增加量相當，可以引起皮質反應[28]。研究表明，使用無Ca2+的玻璃化冷凍液可顯著降低EG引起的胞內[Ca2+]i增加，但對于DMSO引起的[Ca2+]i濃度升高并無影響[9]，揭示內質網鈣庫是胞內[Ca2+]i增加的主要原因。內質網IP3R是主要的鈣釋放通道，對鈣穩態維持起核心作用[29]。2-APB作為IP3R抑制劑，可阻斷內質網鈣庫向胞漿釋放Ca2+，從而阻止胞內[Ca2+]i濃度異常升高[30]。本試驗發現，玻璃化冷凍使卵母細胞皮質顆粒損傷型分布比例顯著升高，然而冷凍前用2-APB處理顯著提高皮質顆粒的皮質區分布比例。表明2-APB可有效阻斷IP3R鈣通道從內質網鈣庫向胞漿中釋放Ca2+，與BAPTA螯合效果一致[11]，顯著降低胞內[Ca2+]i濃度，阻止皮質顆粒提前釋放。

ROS是分子氧在還原過程中的中間產物，具有雙重生物學效應。生理劑量的ROS有利于卵母細胞的成熟和發育，而在卵母細胞體外成熟培養過程中，由于氧濃度、機械處理及其他因素的影響，產生大量ROS，導致脂質過氧化而損傷生物膜，抑制蛋白質和酶類的功能，且出現線粒體功能異常、DNA損傷[31]，從而影響卵母細胞質量和胚胎發育能力[32]。研究發現，ROS如過氧化氫或過氧化物可通過改變Ca2+轉運通道的功能調節胞內氧化還原狀態[33]。研究表明，用H2O2處理人卵母細胞可引起胞內[Ca2+]i濃度短暫升高[34]。另有研究證明，玻璃化冷凍可引起胞內鈣穩態失衡，線粒體功能異常，從而產生大量ROS導致細胞氧化損傷[35]。可見，ROS的產生與胞內[Ca2+]i濃度異常升高有關。本試驗采用2-APB處理卵母細胞，顯著降低了ROS水平，說明2-APB阻斷了IP3R鈣通道從內質網鈣庫向胞漿釋放Ca2+。此外，GSH作為清除氧自由基的清道夫，在細胞的抗氧化系統中起著重要作用，是卵母細胞成熟的重要標志，對后期胚胎發育至關重要[36]。本研究玻璃化冷凍卵母細胞前用2-APB處理，阻斷IP3R鈣通道從內質網鈣庫向胞漿中釋放Ca2+可維持鈣穩態平衡，顯著提高胞內GSH含量，從而提高孤雌激活胚胎發育能力。

4 結 論

本試驗結果表明，在無Ca2+玻璃化冷凍液中，冷凍保存前用2-APB處理卵母細胞，可提高卵母細胞的存活率及卵母細胞內GSH含量，降低卵母細胞皮質顆粒損傷型分布比例和胞內ROS含量，從而改善冷凍-解凍后卵母細胞質量及后期胚胎發育能力。