豬丁型冠狀病毒N蛋白原核表達及其多克隆抗體的制備

劉 銘，張永寧

(中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

豬丁型(δ)冠狀病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV)是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，在分類上屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)[1]。PDCoV是一種新發的豬腸道冠狀病毒，主要感染仔豬，可導致仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和消瘦等臨床癥狀，嚴重者發生死亡，其他年齡段的豬包括母豬也可被感染，但以腹瀉為主要癥狀，已成為影響養豬生產的重要病原之一[2-3]。2012年，Woo等[1]從2009-2010年間采集的豬糞便拭子中首次測得PDCoV的全基因組序列。2014年，Wang等[4-5]從美國俄亥俄州患腹瀉豬的糞便和腸道內容物中再次獲得PDCoV的全基因組序列。隨后，Hu等[6]利用LLC-PK1細胞從患腹瀉豬的糞便和腸道中成功分離到1株PDCoV，并證實PDCoV已在美國多個州的豬群中廣泛流行[7-8]。截至目前，加拿大、中國、韓國、泰國、老撾、越南、日本、墨西哥等國家已報道存在PDCoV感染[9]。研究表明，PDCoV除了感染豬之外，還能感染野鳥、雞、牛等不同種屬動物[10]，說明該病毒具有潛在的跨物種傳播風險。2021年，有研究從3名具有發熱和腹痛癥狀的海地兒童血液中檢出PDCoV，表明PDCoV具有潛在的公共衛生意義[11]。

PDCoV基因組全長25.4 kb左右，從N-端到C-端依次為5′-UTR、ORF1a/1b、刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、輔助蛋白NS6、核衣殼蛋白N、輔助蛋白NS7、3′-UTR和Poly(A)尾[12-13]。PDCoV N蛋白是一種磷酸化的蛋白，與病毒基因組RNA結合形成核衣殼，主要起包裝病毒基因組RNA的作用[14-15]，并與M蛋白共同構成病毒的核心。N蛋白不僅在PDCoV感染的宿主細胞內表達量豐富，可刺激機體產生強烈的免疫反應，且在不同毒株之間相對保守，因此N蛋白已成為PDCoV的重要診斷靶標[16]。采用傳統免疫方法，將抗原物質經不同途徑注入動物體內，經數次免疫后采集動物血液，分離血清，由此獲得的抗血清即為多克隆抗體(polyclonal antibody,PcAb)[17]，多克隆抗體可適應后續大多數的血清學檢測，便于建立穩定性較好的檢測方法。鑒于PDCoV感染導致的臨床癥狀與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PRoV)等感染引起的主要病毒性腹瀉十分相似，因此確診PDCoV感染需依靠實驗室檢測技術。本研究在原核表達與純化PDCoV N蛋白的基礎上制備其多克隆抗體，旨在為PDCoV血清學檢測方法的優化及開展PDCoV相關基礎研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞和載體 PDCoV CHN-HN-1601毒株(GenBank登錄號：MG832584.1)、PEDV BJ-2011-C毒株(GenBank登錄號：KX066126.1)、豬腸道甲型冠狀病毒(PEAV)GDZQ-2018毒株(GenBank登錄號：MW727454)、TGEV Jms 毒株、LLC-PK1細胞、Vero細胞、ST細胞、原核表達載體pET-28a(+)均由中國農業大學農業農村部動物流行病學重點實驗室保存；MA104細胞、PRoV OSU毒株均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.1.2 試驗動物 2月齡體重約1.8 kg的雌性新西蘭白兔購自北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司。

1.1.3 主要試劑 ClonExpress?Ⅱ非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒(Vazyme公司)；BamH Ⅰ和XhoⅠ(New England BioLabs公司)；NP-40裂解液、DAPI細胞核染色液和IPTG(Solarbio?Life Sciences公司)；Ni-NTA瓊脂糖樹脂(Qiagen公司)；病毒RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；Protein A/G瓊脂糖樹脂(Beyotime公司)；一步法RT-PCR試劑盒、預染蛋白質分子質量標準、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG、HRP-山羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；ECL發光液(Engreen公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據PDCoV CHN-HN-1601毒株N基因序列設計1對引物，并在上、下游引物5′-端分別引入BamH Ⅰ和XhoⅠ的識別位點。上游引物：5′-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATG-

GCCGCACCAGTAGTC-3′(下劃線序列為BamH Ⅰ酶切位點);下游引物:5′-GTGGTGGTGGTGGTG-

GTGCTCGAGCGCTGCTGATTCCTGCTT-3′(下劃線序列為XhoⅠ酶切位點)。下游引物中N基因的終止密碼子(TAG)已被去除，預期擴增片段大小為1 071 bp，其中N基因為1 026 bp(不含終止密碼子)，其他堿基為同源臂序列。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 PDCoVN基因擴增 利用病毒RNA提取試劑盒提取CHN-HN-1601毒株的基因組RNA，借助一步法RT-PCR擴增PDCoVN基因序列。PCR反應體系50 μL：2×Reaction Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，SuperScriptTMⅡ Ⅰ RT/PlatinumTMTaqMix 2 μL，PDCoV RNA 10 μL，RNase-free ddH2O補至50 μL。PCR反應條件：55 ℃反轉錄15 min；94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共35個循環；68 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離PCR產物，切膠純化回收。

1.2.3 原核表達質粒的構建與鑒定 利用BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切回收后的PCR產物和pET-28a(+)載體，對酶切產物再次進行膠回收后，借助同源重組技術構建重組質粒pET-28a-PDCoV-N。反應體系20 μL：線性化載體112 ng，目的片段41 ng，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，ddH2O補至20 μL；37 ℃連接30 min。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將菌液涂布于含卡那霉素的LB平板進行培養。挑取單菌落接種含卡那霉素的液體LB培養基擴繁后，抽提重組質粒分別進行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定、PCR鑒定和質粒測序鑒定。

1.2.4 重組PDCoV-N蛋白的誘導表達與可溶性分析 將鑒定正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取單菌落接種于10 mL含卡那霉素的LB液體培養基，37 ℃、200 r/min振搖過夜培養；按1∶150的比例接種于含卡那霉素的LB培養基，37 ℃、200 r/min振搖培養至D600 nm值達0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、200 r/min誘導12 h。于誘導前后各收集1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，對菌體進行SDS-PAGE分析。另取150 mL誘導12 h的菌液，8 000 r/min離心10 min，利用裂解液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH 8.0)重懸菌體沉淀，超聲波破碎菌體(300 W，破碎5 s，間歇5 s，180次)，10 000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組PDCoV-N蛋白的純化 利用20 mL裂解液重懸600 mL菌液的菌體沉淀，置冰上進行超聲波破碎后，10 000 r/min離心30 min，收集上清液，利用0.22 μm濾器去除雜質；向濾液中加入1 mL Ni-NTA瓊脂糖樹脂，4 ℃緩慢混勻12 h；將N蛋白與樹脂的混合液裝柱，分別利用10倍柱體積的洗滌液(咪唑濃度依次為20、75和100 mmol/L)各洗滌1次，最后利用1 mL洗脫液(咪唑濃度為250 mmol/L)洗脫重組N蛋白，利用BCA法測定蛋白質濃度。

1.2.6 重組PDCoV-N蛋白多克隆抗體的制備 于免疫前經心臟采集15 mL兔血液用于血清分離，作為陰性對照血清。初次免疫按照1 mg/只的劑量將重組PDCoV-N蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，經背部皮下多點注射免疫新西蘭白兔；2周后加強免疫，共加強免疫3次，每次間隔2周，每次免疫劑量為1 mg/只，蛋白改用不完全弗氏佐劑乳化，背部皮下多點注射免疫；末次加強免疫劑量為1.5 mg/只，耳緣靜脈注射，7 d后心臟采血。

1.2.7 多克隆抗體的純化與保存 利用Protein A/G瓊脂糖樹脂親和層析法純化多克隆抗體。將5 mL兔抗血清用0.22 μm濾器去除雜質后過2遍柱子，經TBS緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4)徹底洗滌后，利用甘氨酸洗脫液(pH 2.7)進行洗脫，并借助Tris-HCl緩沖液(1 mol/L，pH 8.0)將洗脫液的pH調至7.4，防止抗體變性。利用TBS對純化后的多克隆抗體過夜透析，經BCA法測定抗體濃度后，-20 ℃保存備用。

1.2.8 多克隆抗體效價測定 利用間接ELISA測定多克隆抗體效價[18]。將重組PDCoV-N蛋白以200 ng/孔的劑量4 ℃過夜包被ELISA板；經PBST洗滌后，利用含5%脫脂乳的PBS進行封閉，200 μL/孔，37 ℃封閉1 h；經PBST洗滌后，向孔內分別加入多克隆抗體2倍系列稀釋液(1∶100至1∶204 800)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，同時設置同等稀釋度的非免疫兔血清作為陰性對照；經PBST洗滌后，向各孔加入100 μL 1∶4 000稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；經PBST洗滌后，向各孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫避光反應15 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應；利用Thermo Multiskan FC型酶標儀測定D450 nm值。

1.2.9 多克隆抗體的Western blotting鑒定 取10 μL純化后的重組PDCoV-N蛋白進行SDS-PAGE，通過濕式轉印法將蛋白質轉印至PVDF膜上，經含5%脫脂乳的PBST 4 ℃過夜封閉后，將膜與多克隆抗體稀釋液(1∶1 000)于37 ℃孵育1 h；經PBST徹底洗滌后，將膜與HRP-山羊抗兔IgG稀釋液(1∶8 000)于37 ℃孵育1 h；經PBST徹底洗滌后，向膜上滴加ECL發光液顯色，利用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系統拍照。

為進一步驗證制備的多克隆抗體能否識別PDCoV，將PDCoV CHN-HN-1601毒株接種6孔細胞培養板中的LLC-PK1細胞(感染復數MOI為1)，同時設置不接毒的陰性細胞對照。于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h后，收集細胞，利用NP-40裂解液裂解細胞(150 μL/孔)，10 000×g離心10 min，取上清液進行Western blotting分析。

1.2.10 多克隆抗體的間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定 待96孔細胞培養板中的LLC-PK1細胞長至80%匯合度時，接種PDCoV CHN-HN-1601毒株(MOI=1)，同時設置陰性對照細胞，置37 ℃、5% CO2培養箱繼續培養24 h。利用預冷無水甲醇4 ℃固定細胞30 min，經PBS洗滌后，向細胞中加入1∶1 000稀釋的多克隆抗體，置于37 ℃孵育1 h。利用PBS洗滌3次，向細胞中加入1∶1 000稀釋的Alexa Fluor 488-山羊抗兔IgG，置于37 ℃孵育1 h。經PBS 3次洗滌后，DAPI染細胞核，利用Nikon ECLIPSE Ts2-FL型熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.11 多克隆抗體的特異性試驗 利用IFA分析PDCoV-N蛋白多克隆抗體與PEDV、TGEV、PRoV可引起腹瀉的豬腸道冠狀病毒的交叉反應情況，具體操作同1.2.10。

2 結 果

2.1 重組表達質粒pET-28a-PDCoV-N的構建與鑒定

以PDCoV RNA為模板，基于設計的N基因引物利用RT-PCR擴增獲得1條約1 071 bp的片段(圖1)，與預期大小一致。對重組質粒pET-28a-PDCoV-N進行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得約1 036 bp的目的片段和pET-28a(+)載體片段，大小均與理論值相符；對重組質粒進行PCR鑒定，可擴增出約1 071 bp的目的片段(圖2)。質粒測序結果進一步表明，N基因序列、插入位置及閱讀框都準確無誤。

M，Trans 2K? Plus Ⅱ DNA Marker；1，PDCoV RNA；2，陰性對照

M，Trans 2K? Plus Ⅱ DNA Marker；1，pET-28a-PDCoV-N BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定；2，pET-28a-PDCoV-N PCR鑒定

2.2 重組PDCoV-N蛋白的誘導表達與可溶性分析

轉化pET-28a-PDCoV-N的大腸桿菌BL21經0.5 mmol/L IPTG誘導12 h后，SDS-PAGE分析發現，在約42 ku處出現一條明顯表達的蛋白條帶，其大小與重組PDCoV-N蛋白的理論值相符，且重組PDCoV-N蛋白在上清和包涵體中均有表達(圖3)。

M，蛋白質分子質量標準；1，誘導的pET-28a-PDCoV-N；2，未誘導的pET-28a-PDCoV-N；3，誘導的pET-28a(+)；4，未誘導的pET-28a(+)；5，誘導的大腸桿菌BL21(DE3)；6，未誘導的大腸桿菌BL21(DE3)；7，誘導pET-28a-PDCoV-N上清；8，誘導pET-28a-PDCoV-N沉淀

2.3 重組PDCoV-N蛋白的純化

SDS-PAGE結果顯示，上清可溶性N蛋白純化后的純度可達90%(圖4)，經BCA法測定其終濃度為0.45 mg/mL。

M，預染蛋白質分子質量標準；1，未純化的重組PDCoV-N蛋白；2，純化的重組PDCoV-N蛋白

2.4 抗體純化效果鑒定

將兔血清用0.22 μm濾器去除雜質經TBS緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4)徹底洗滌后，利用甘氨酸洗脫液(pH 2.7)進行5次洗脫，經SDS-PAGE分析發現，第2、3次洗脫得到的抗體量最大，純化后PDCoV-N蛋白多克隆抗體的重鏈和輕鏈清晰可見(圖5)，純化過程中抗體損失較少，抗體純度較高。

2.5 多克隆抗體的效價測定

以純化后的重組PDCoV-N蛋白為包被抗原，利用間接ELISA測定多克隆抗體的效價，并以多克隆抗體孔與陰性血清對照孔D450 nm的比值(P/N)>2.1時，對應多克隆抗體的最高稀釋度定義為多克隆抗體的效價。結果表明，純化后的兔抗PDCoV-N蛋白多克隆抗體的ELISA效價達1∶6 400(圖6)。

圖6 PDCoV-N蛋白多克隆抗體效價的ELISA測定

2.6 多克隆抗體的Western blotting鑒定

以純化的多克隆抗體為一抗，利用Western blotting檢測多克隆抗體與原核表達的PDCoV-N蛋白及PDCoV感染的LLC-PK1細胞內天然N蛋白的反應情況。結果表明，制備的多克隆抗體能識別原核表達的PDCoV-N蛋白，在約42 ku處產生1條蛋白條帶(圖7A)，其大小與重組PDCoV-N蛋白的理論值相符(包括N-端和C-端的6×His標簽及與N蛋白融合表達的部分載體序列)。此外，該多克隆抗體也能識別PDCoV感染細胞內的天然N蛋白，在38 ku處產生一條蛋白條帶(圖7B)，與PDCoV天然N蛋白的理論值相符。

M，預染蛋白質分子質量標準；1，純化的重組PDCoV-N蛋白；2，陰性對照LLC-PK1細胞總蛋白；3，PDCoV感染的LLC-PK1細胞總蛋白

2.7 多克隆抗體的IFA鑒定及特異性分析

以制備的多克隆抗體為一抗，利用IFA分析其與PDCoV的反應情況。結果表明，PDCoV感染的LLC-PK1細胞的胞質內出現了特異性的綠色熒光信號，而陰性對照細胞內未見熒光信號(圖8)，表明制備的多克隆抗體能很好地識別PDCoV。特異性試驗結果表明，該多克隆抗體與PEDV、TGEV、PRoV致腹瀉的豬腸道冠狀病毒無交叉反應(圖8)，說明該多克隆抗體具有良好的特異性。

A，PDCoV感染的LLC-PK1細胞(400×)；B，LLC-PK1細胞陰性對照(400×)；C，PEDV感染的Vero細胞(200×)；D，TGEV感染的ST細胞(200×)；E，PRoV感染的MA104細胞(200×)

3 討 論

作為一種新發現的豬腸道致病性冠狀病毒，PDCoV已在全球主要的生豬生產國家和地區廣泛流行，給養豬業造成了較大的經濟損失[19]。快速和準確地診斷對于控制PDCoV的進一步傳播與蔓延至關重要。臨床上，PDCoV感染引起的仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和消瘦等癥狀與PEDV、TGEV、PRoV等主要病毒性腹瀉病原感染等極其相似，因此，確診PDCoV感染離不開實驗室檢測技術。

目前，國內外已研發了基于PDCoVN或M基因的RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、恒溫熱隔絕式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR)和重組酶聚合酶擴增(RPA)等分子生物學檢測方法，可用于患病豬糞便及組織樣本中PDCoV核酸的檢測[20]。相較于分子生物學方法，PDCoV血清學檢測方法的研發工作相對滯后。多克隆抗體高度異質，可與多種抗原表位結合，難避免非特異性反應，但穩定性較好。用人工方法將產生特異性抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合，形成B細胞雜交瘤，由克隆化的B細胞雜交瘤所產生的的抗體即為單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)。單克隆抗體高度同質，與特定抗原表位結合，交叉反應不常見，但穩定性較差[17]。Chen等[2]建立了基于PDCoV M蛋白兔抗血清的IFA和免疫組化(IHC)檢測方法；Wang等[21]在制備PDCoV N蛋白鼠源特異性單克隆抗體和兔源多克隆抗體的基礎上建立了可檢測PDCoV及其N蛋白的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA);Su等[22]利用原核表達載體pET-32a(+)制備了PDCoV-N的His融合蛋白，并建立了基于該蛋白的PDCoV抗體的間接ELISA檢測方法；Okda等[16]借助原核表達載體pET-28a(+)也獲得了PDCoV-N的His融合蛋白，進而建立了基于N蛋白的熒光微球免疫學檢測方法(FMIA)，可實現豬血清中PDCoV抗體的高通量篩查。上述研究表明，PDCoV血清學檢測方法的成功建立離不開診斷抗原的表達、純化及其多克隆抗體和單克隆抗體的制備。為了研發一種適于現場診斷且具有更多識別位點、檢測更敏感的PDCoV免疫層析檢測方法，有必要進一步制備純度高、抗原性好的重組PDCoV-N蛋白，并制備其特異性的多克隆抗體。

本研究利用原核表達載體pET-28a(+)對PDCoV-N蛋白進行了表達，并借助載體多克隆位點兩端攜帶的His標簽對重組PDCoV-N蛋白進行了親和純化。Okda等[16]研究發現，利用pET-28a(+)表達的PDCoV-N蛋白主要存在于包涵體中，需經過蛋白質復性后才能用作間接ELISA和FMIA的包被抗原。由于從包涵體中純化蛋白質需進行復性而難以保證重組蛋白的抗原性，因此，本研究在誘導表達PDCoV-N蛋白時對誘導條件進行了優化，最終選擇0.5 mmol/L IPTG在37 ℃誘導12 h獲得了可溶性的PDCoV-N蛋白。由于重組PDCoV-N蛋白的N-端和-C端均攜帶6×His標簽，故選擇在非變性條件下使用Ni-NTA瓊脂糖樹脂從菌體裂解液的上清中純化N蛋白。為提高PDCoV-N蛋白的純度，本研究在純化蛋白的過程中逐漸提高了洗滌緩沖液中的咪唑濃度(由20 mmol/L提高至100 mmol/L)，最終獲得了純度90%左右的重組PDCoV-N蛋白。純化后的重組N蛋白具有良好的抗原性，成功誘導免疫的家兔產生了特異性的免疫應答。借助Protein A/G樹脂從免疫兔的血清中成功純化出抗PDCoV-N蛋白的多克隆抗體，其效價達1∶6 400。鑒于PDCoV與PEDV、TGEV、PRoV等致腹瀉病毒同屬于冠狀病毒科，因此有必要分析所制備的PDCoV-N蛋白多克隆抗體的特異性。本研究用IFA檢測了多克隆抗體與PEDV、TGEV和PRoV的交叉反應情況。結果發現，雖然這幾種病毒的親緣關系較近，但本研究所制備的多克隆抗體僅識別PDCoV-N蛋白和PDCoV毒株，與PEDV、TGEV、PRoV不存在交叉反應，說明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。本試驗結果與Su等[22]報道的研究結果一致，即基于PDCoV-N的His融合蛋白的間接ELISA與PEDV豬抗血清無交叉反應。Ma等[23]研究發現，美國的PEDV VBS2毒株與PDCoV Michigan/8977/2014毒株的N蛋白之間可能存在1個或多個共同的抗原表位，具體表現為這2個毒株與對方的豬抗血清之間存在雙向交叉反應；2個毒株之間的交叉反應僅出現在間接ELISA和Western blotting試驗中，而在IFA或IHC檢測病毒感染細胞、攻毒豬的腸道組織以及病毒中和試驗中未出現；然而，該研究并未進一步闡明該表位在N蛋白中的具體位置。因此，目前本研究無法分析中國豬場中PDCoV流行毒株及本研究中所使用的CHN-HN-1601毒株的N蛋白中是否也存在一個類似的抗原表位，仍有待于進一步試驗證實。

4 結 論

本研究借助原核表達系統與鎳柱親和層析純化方法，在獲得高純度重組PDCoV-N蛋白的基礎上，制備了N蛋白的兔源多克隆抗體。該多克隆抗體能特異性識別重組的PDCoV-N蛋白及PDCoV的天然N蛋白，與PEDV、TGEV、PRoV 3種主要致腹瀉的豬腸道冠狀病毒無交叉反應。重組PDCoV-N蛋白及其多克隆抗體的成功制備，可為PDCoV免疫層析方法的建立及開展PDCoV相關基礎研究提供參考借鑒。