馬兜鈴酸Ⅰ對大鼠五臟的毒性及功能影響

汪 瑤，燕 鴿，劉智慧，王 玉，辛全超，曹新悅，于文會,2，姜曉文

(1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱150030；2.東北農業大學中獸醫研究所，哈爾濱 150030)

馬兜鈴科屬的植物大多數生長在溫帶或溫熱帶，據統計，在全世界范圍內生長的約有450多種，在中國現有56種[1]。大多數馬兜鈴科屬中藥都具有止咳平喘、行氣活血、舒經止痛等功效[2]。馬兜鈴味苦，性微寒，歸肺臟、大腸經，具有止咳、平喘、祛痰、抗炎、抗菌等功效[3]。一些馬兜鈴科屬的植物具有毒性，毒性大小與自身所含的馬兜鈴酸(aristolochic acids，AA)密切相關。AA是一類硝基菲類有機酸類化合物，由于羥基和甲氧基在骨架上出現的位置不同，導致AA類化合物種類繁多[4]，其毒性大小也不相同。最常見的AA類化合物是AA-Ⅰ和AA-Ⅱ(圖1)及馬兜鈴內酰胺Ⅰ(aristololactams-Ⅰ，AL-Ⅰ)，其中AA-Ⅰ與AL-Ⅰ為馬兜鈴屬植物中毒性最強的成分[5]。AA-Ⅰ具有較強的毒性，而AL-Ⅰ的毒性更強[6-7]。AA-Ⅰ與DNA形成DNA加合物，使A/T堿基對發生易位[8]，從而導致腫瘤發生[9]。盡管《中國藥典》已將關木通、天仙藤等含AA含量較高的中藥刪除，但是《中國獸藥典》第5版仍收錄了關木通、天仙藤、馬兜鈴、朱砂蓮等中藥，其中以朱砂蓮中AA-Ⅰ含量最高[10]。

圖1 AA-Ⅰ(A)和AA-Ⅱ(B)結構圖

有報道稱，AA-Ⅰ是巴爾干地方性腎病臨床綜合征的病原體[11]。1962年，吳松寒[12]首次發現AA具有腎臟毒性，后來Vanherweghem將其命名為“中草藥腎病”[13]。目前，AA腎臟損傷的發病機制研究尚不明確，但國內、外學者就AA造成慢性腎間質纖維化的結論較為一致[14-15]。氧化應激是AA-Ⅰ引起腎臟毒性的重要途徑，AA-Ⅰ暴露會損害腎臟的抗氧化防御系統，導致腎小管上皮細胞線粒體損傷、細胞凋亡和自噬等，進而導致腎功能衰竭[16-20]。因此，馬兜鈴屬類中藥用藥安全必須引起獸醫師的高度關注。依據中藥歸經的特性，AA進入機體后在五臟的分布可能存在靶向性。為了探究AA進入機體后在五臟的含量及其相應的毒性關系，本試驗以大鼠為研究對象，通過給大鼠灌服AA-Ⅰ檢測AA-Ⅰ、AL-Ⅰ在五臟中出現的時間及含量，以及對五臟功能影響的評價，以期為今后含有AA類中藥的臨床用藥安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡健康成年雄性SD大鼠33只(200 g±20 g)購自遼寧長生生物科技有限公司(No.SCXK 2020-0001)。在22 ℃±2 ℃下進行12 h光照/黑暗循環，自由進食標準顆粒飼料和飲用水。試驗前適應性飼養1周。

AA-Ⅰ(純度≥96%，CAS號313-67-7)和AL-Ⅰ(純度≥98%，CAS號13395-02-3)均購自南京道斯夫生物科技有限公司。試驗所用化學試劑均為色譜純。

1.2 AA-Ⅰ及AL-Ⅰ在大鼠五臟中的方法學確定

用甲醇精準配制濃度為50 μg/mL的AA-Ⅰ和AL-Ⅰ儲備液，密封后置于4 ℃保存備用。各取20 μL儲備液及兩者各10 μL混合儲備液作為標準品，用于HPLC的檢測。取AA-Ⅰ和AL-Ⅰ儲備液適量，加甲醇稀釋分別制得1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和30.0 μg/mL的梯度溶液。取0.1 mL不同濃度AA-Ⅰ和AL-Ⅰ對照品儲備液，分別加入到0.3 g空白對照組的五臟組織中進行勻漿，渦旋混勻10 s后分別按以下方法處理樣品：取含有不同濃度對照品儲備液的五臟組織勻漿，加入2 mol/L HCl 100 μL酸化，渦旋混勻10 s，加入50倍95%乙醇旋渦混勻3 min，再以3 000 r/min離心15 min，靜置后吸取上清液于真空干燥箱中烘干，殘渣以甲醇復溶并過濾，吸取20 μL用于HPLC檢測。色譜條件為：色譜柱：Hypersil BDS(C18，5 μm)；柱溫：25 ℃；檢測波長：390 nm；進樣量：20 μL；流動相：甲醇∶水∶冰醋酸(70∶30∶0.5，V/V/V)；流速：1 mL/min；時間：15 min。

1.3 高效液相法檢測大鼠五臟中AA-Ⅰ及AL-Ⅰ含量

1.3.1 試驗動物分組及樣品采集 取健康雄性SD大鼠21只，分為2組，AA-Ⅰ組18只，空白對照組3只，試驗前適應性飼養1周，給藥前禁食至少12 h。AA-Ⅰ用聚乙二醇(PEG)進行稀釋，以20 mg/kg體重劑量灌服大鼠[21]，空白對照組只灌胃PEG，每天一次，連續給藥7 d，分別在末次給藥后0.2、0.5、1、2和24 h各隨機剖殺3只大鼠，空白對照組于第8天剖殺，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟經預處理后采用HPLC法檢測AA-Ⅰ及AL-Ⅰ在各組織中的濃度。停藥后15 d[22]，再剖殺3只大鼠，通過預處理后采用HPLC法測量AA-Ⅰ及AL-Ⅰ在各組織中的濃度。

1.3.2 組織樣品前處理 取各組織0.3～1 g，按照1∶3(W/V)加入生理鹽水進行研磨，制備組織勻漿液。取100 μL組織勻漿液，加入2 mol/L HCl 100 μL酸化，旋渦混勻10 s，加入50倍95%乙醇旋渦混勻3 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液，45 ℃真空干燥回收，殘渣以2 mL甲醇超聲復溶，過0.22 μm濾膜，取20 μL進行HPLC分析。

1.3.3 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18(2.1 mm×50 mm，5 μm，美國賽默飛科技有限公司)，流動相：甲醇∶水∶冰醋酸(70∶30∶0.5，V/V/V)；檢測波長：390 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

1.4 AA-Ⅰ對大鼠五臟毒性檢測

1.4.1 試驗動物分組及樣品采集 取健康雄性SD大鼠12只，分為2組，AA-Ⅰ組和空白對照組各6只。以20 mg/kg體重劑量連續給藥7 d后，于第8天兩組各隨機取3只大鼠，眼眶取血，部分置于肝素鋰管中留取全血進行血氣和血常規檢測；部分置于離心管室溫靜置30 min后，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取血清進行生化檢測。之后斷頸處死，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，部分保存于4%甲醛溶液中備用；部分用生理鹽水沖洗凈后于―80 ℃保存備用。剩余大鼠停藥15 d后，以相同方法采集全血，分離血清，采集五臟組織。

1.4.2 心臟、肝臟及腎臟功能檢測 取50 μL血清于1 mL離心管中，用半自動生化測定儀(深圳市盛信康科技有限公司)檢測肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)及肌酐(creatinine，Cre)指標。

1.4.3 肺臟功能檢測 取1 mL動脈血于肝素鋰離心管中，用血氣分析儀(北京冠遠科技有限公司)檢測pH、動脈血氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)指標。

1.4.4 脾臟功能檢測 取脾臟組織進行組織勻漿，通過腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測分析。

1.4.5 五臟氧化應激損傷的檢測 分別取0.1 g組織樣品，加入預冷的生理鹽水900 μL，勻漿后得到10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，收集上清。按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測各組織的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量(TBA法)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性(羥胺法)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性(比色法)，測定相應的D值，并計算抗氧化指標。

1.4.6 五臟病理組織的檢測 肉眼觀察各組織樣的組織病變，每組采集同一只大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，用4%甲醛溶液固定，制作石蠟切片，并進行HE染色，通過光學顯微鏡觀察切片病理變化。

1.5 統計分析

使用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行單因素方差法分析(One-Way ANOVA)，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 AA-Ⅰ和AL-Ⅰ在大鼠五臟中的方法學結果

AA-Ⅰ和AL-Ⅰ標準品出峰時間分別約為7.1和8.9 min，且兩者混合后測得相應時間段峰值可良好區分。AA-Ⅰ和AL-Ⅰ標準品濃度分別在12.5～50和6.25～25 μg/mL范圍內，樣品的峰面積與濃度均呈正相關，線性關系良好，R2均>0.99(表1)，且五臟中AA-Ⅰ和AL-Ⅰ標準品的精密度、穩定性、回收率均符合要求。

表1 AA-Ⅰ和AL-Ⅰ在大鼠五臟中的回歸方程

2.2 AA-Ⅰ和AL-Ⅰ在大鼠五臟中的含量

由表2可知，末次給藥后0.25 h，在大鼠心臟、肝臟、脾臟及肺臟中均檢測到AA-Ⅰ，其中肝臟中含量最高，此時在肝臟和脾臟中均檢測到AL-Ⅰ，且肝臟中含量高于脾臟；末次給藥后0.5 h，在五臟中均檢測到AA-Ⅰ，其中在肝臟中含量最高，腎臟次之，此時肝臟、肺臟及腎臟中均檢測到AL-Ⅰ，其中肝臟中含量最高，腎臟次之；末次給藥后1 h，在肝臟和肺臟中檢測到AA-Ⅰ，且肺臟中含量高于肝臟，此時只在肝臟中檢測到AL-Ⅰ；末次給藥后2 h，在心臟、肝臟、肺臟及腎臟中檢測到AA-Ⅰ，其中肝臟中含量最高，此時只在腎臟中檢測到AL-Ⅰ；末次給藥后24 h，在心臟和肝臟中檢測到AA-Ⅰ，此時只在肝臟中檢測到AL-Ⅰ；停藥后15 d，五臟中均未檢測到AA-Ⅰ和AL-Ⅰ。

表2 大鼠五臟中AA-Ⅰ和AL-Ⅰ含量

2.3 AA-Ⅰ對大鼠五臟毒性檢測結果

2.3.1 心臟毒性 由表3可知，連續給藥7 d并停藥15 d后，給藥組大鼠心臟中CK含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，而停藥后15 d與空白對照組間無顯著差異(P>0.05)；給藥組與停藥后15 d LDH含量均極顯著高于空白對照組(P<0.01)；給藥組GSH-Px、SOD活性及T-AOC均極顯著或顯著低于空白對照組(P<0.01；P<0.05)；停藥后15 d GSH-Px活性顯著低于空白對照組(P<0.05)，SOD活性、T-AOC低于空白對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；給藥組MDA含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，停藥后15 d低于空白對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。

表3 AA-Ⅰ對大鼠心臟毒性檢測

2.3.2 肝臟毒性 由表4可知，連續給藥7 d并停藥15 d后，給藥組與停藥后15 d大鼠肝臟中AST、ALT活性均顯著或極顯著高于空白對照組(P<0.05；P<0.01)；給藥組與停藥后15 d GSH-Px和SOD活性均顯著或極顯著低于空白對照組(P<0.05；P<0.01)；給藥組T-AOC顯著低于正常對照組(P<0.05)，而停藥后15 d低于空白對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；給藥組MDA含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，而停藥后15 d與空白對照組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 AA-Ⅰ對大鼠肝臟毒性檢測

2.3.3 脾臟毒性 由表5可知，連續給藥7 d并停藥15 d后，給藥組大鼠脾臟中IL-1、TNF-α含量均極顯著高于空白對照組(P<0.01)；給藥組與停藥后15 d GSH-Px和SOD活性均極顯著低于空白對照組(P<0.01)，給藥組T-AOC顯著低于空白對照組(P<0.05)，停藥后15 d低于空白對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；給藥組MDA含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，停藥后15 d高于空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表5 AA-Ⅰ對大鼠脾臟毒性檢測

2.3.4 肺臟毒性 由表6可知，連續給藥7 d并停藥15 d后，給藥組和停藥后15 d大鼠肺臟中PaCO2和PaO2均極顯著或顯著低于空白對照組(P<0.01；P<0.05)；給藥組與停藥后15 d GSH-Px、SOD活性均極顯著或顯著低于空白對照組(P<0.01；P<0.05)；給藥組T-AOC極顯著低于空白對照組(P<0.01)，停藥后15 d低于空白對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；給藥組MDA含量極顯著高于空白對照組(P<0.01)，停藥后15 d高于空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 AA-Ⅰ對大鼠肺臟毒性檢測

2.3.5 腎臟毒性 由表7可知，連續給藥7 d并停藥15 d后，給藥組與停藥后15 d大鼠腎臟中BUN、CRE含量均極顯著高于空白對照組(P<0.01)；給藥組與停藥后15 d腎臟中GSH-Px、SOD活性均極顯著低于空白對照組(P<0.01)；給藥組腎臟中T-AOC顯著低于空白對照組(P<0.05)，停藥后15 d低于空白對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；給藥組腎臟中MDA含量顯著高于空白對照組(P<0.05)，而停藥后15 d與空白對照組間無顯著差異(P>0.05)。

表7 AA-Ⅰ對大鼠腎臟毒性檢測

2.3.6 大鼠五臟組織學檢測結果 由圖2可知，給藥組大鼠心臟偶見顆粒變性和空泡變性，而停藥后15 d大鼠心臟心肌肥大；給藥組大鼠肝細胞水樣變性，胞漿呈空殼狀，可見小灶狀壞死和胞漿浸潤，少量肝細胞彌漫性氣球樣變，胞質呈顆粒狀變性，而停藥后15 d肝小葉排列清楚，周圍肝細胞出現彌漫性水樣變性；給藥組大鼠和停藥后15 d大鼠同空白對照組的脾臟相比未見異常；給藥組大鼠部分肺臟組織可見肺間質炎性改變，肺泡壁增厚并有炎性細胞浸潤，并可見炎癥，肺臟組織代償性肺氣腫，肺泡壁斷裂，融合成大腔，而停藥后15 d大鼠肺臟偶見肺泡壁增厚，有炎性細胞浸潤，局部有代償性肺氣腫；給藥組大鼠腎小管上皮細胞水樣變性，停藥后15 d大鼠腎間質炎癥，有炎性細胞浸潤，腎小管結構消失，也可見腎小管上皮細胞水樣變性。

圖2 大鼠五臟組織病理學觀察(400×)

3 討 論

用建立的HPLC方法測定大鼠五臟中的AA-Ⅰ及AL-Ⅰ，結果表明，在相應濃度范圍內各標準品峰面積與濃度線性關系良好，能反映給藥后不同時間點AA-Ⅰ及AL-Ⅰ在體內的歸經和代謝情況，同時通過方法學驗證，其精密度、穩定性和回收率均符合要求，因此AA-Ⅰ及AL-Ⅰ體內檢測方法準確可行。末次給藥后0.25 h，除腎臟外，其余四臟均檢測到AA-Ⅰ，其中肝臟含量最高，而AL-Ⅰ只在肝臟與脾臟中檢測到，肝臟中含量依然高于脾臟；末次給藥后0.5 h，五臟中均檢測到AA-Ⅰ，其中肝臟中含量最高，腎臟中含量次之；而AL-Ⅰ在肝臟、肺臟與腎臟中均可檢測到，其中肝臟含量最高，其次是腎臟，AA-Ⅰ在腎臟內積聚會造成腎功能損害；末次給藥后1 h，只在肝臟和肺臟檢測到AA-Ⅰ，此時肺臟中含量高于肝臟，而AL-Ⅰ在肝臟中可檢測到；末次給藥后2 h，除脾臟外，其余四臟均可檢測到AA-Ⅰ，含量最高的為肝臟，而AL-Ⅰ只在腎臟中檢測到；末次給藥后24 h，AA-Ⅰ只在心臟與肝臟中檢測到，此時AL-Ⅰ只在肝臟中檢測到；停藥后15 d，五臟中雖然檢測不到AA-Ⅰ及AL-Ⅰ，但五臟損傷沒有得到較好修復，與空白對照組相比仍差異顯著。馬兜鈴酸的主要靶器官為肝臟和腎臟，本試驗中，末次給藥后1 h在心臟、腎臟中均沒有檢測到AA-Ⅰ，而在末次給藥后2 h檢測到AA-Ⅰ；末次給藥后2 h在肝臟中沒有檢測到AL-Ⅰ，而在末次給藥后24 h卻檢測到AL-Ⅰ；末次給藥后1 h在腎臟中沒有檢測到AA-Ⅰ，而在末次給藥后2 h檢測到AA-Ⅰ。推測是AA-Ⅰ轉化成AL-Ⅰ的酶存在于肝臟中。研究表明，在NADPH∶醌氧化還原酶1(NQO1)作用下，AA-Ⅰ在肝臟中轉化為N羥基馬兜鈴內酰胺，然后在硫酸基轉移酶(SULTs)的作用下再次硫酸化，并被多藥耐藥相關蛋白(MRP)轉運到腎臟發揮腎毒性[22-23]。這可能是在腎臟和心臟中有些時間點沒有檢出AA-Ⅰ的原因。從AA-Ⅰ及AL-Ⅰ在五臟中的檢測結果看，AA-Ⅰ及AL-Ⅰ主要蓄積在肝臟和腎臟，AA-Ⅰ可能在肝臟或腎臟發生生物轉化[16]，但是否在肝臟和/或腎臟均可發生生物轉化鮮見報道，有待進一步研究。停藥15 d后檢測發現，各個臟器中均檢測不到AA-Ⅰ和AL-Ⅰ，可能原因就是檢測限限制或者是AL-Ⅰ形成了DNA加合物，無法通過HPLC檢測出來，因此還需要今后進一步的檢測。

有毒物質誘發的氧化應激可破壞細胞的抗氧化系統，誘導活性氧(ROS)大量蓄積，從而引起機體一系列的自我調控，導致細胞產生損傷和抵御能力的加強[24-25]。機體利用自身抗氧化酶系統能夠很好地對抗氧自由基，實現抗氧化目的，而機體中主要的抗氧化酶就是SOD、T-AOC和GSH-Px，這類抗氧化酶能夠很大程度地平衡抗氧化系統和氧化系統，也是最常見的衡量抗氧化能力指標[26]；作為細胞質過氧化的直接產物，MDA含量是說明機體氧化應激損傷程度的指標[27]。本研究發現，給藥組與停藥后15 d五臟中GSH-Px、SOD活性及T-AOC均低于空白對照組，說明AA-Ⅰ會導致機體抗氧化酶活性降低，從而誘發五臟出現明顯損傷。研究表明，AA-Ⅰ通過氧化應激誘導了DNA損傷，AA-Ⅰ治療人早幼粒細胞白血病細胞(HL-60)和人腎近端小管細胞(HK-2)導致ROS的劑量依賴性增加[28]。AA導致的腎小管壞死屬腎陽虛證，機體的氧化應激損傷是其主要致病機制[29]。給藥組五臟中MDA含量均極顯著高于空白對照組，也同樣說明AA-Ⅰ可誘導機體氧化應激。

AA-Ⅰ可導致肝臟、腎臟、心臟損傷，這些損傷在其組織病理學上得到了認證。有報道表明，AA-Ⅰ引起氧化應激導致肝臟損傷[30]和腎臟損傷[31]；AA-Ⅰ可通過炎癥介導引起石斑魚的心臟衰竭[32-33]。血氣指標PaCO2、PaO2反映了肺臟的呼吸功能[34]，給藥組與停藥后15 d均極顯著或顯著低于空白對照組，說明AA-Ⅰ可致肺臟損傷；肺臟的病理切片可見肺間質炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，局部有代償性肺氣腫，肺泡壁斷裂，融合成大腔等病理變化；且AA-Ⅰ可能會引起肺腫瘤的發生[35-36]。脾臟是機體最大的外周免疫器官，與炎癥密切相關。AA-Ⅰ可引起脾臟中炎癥指標IL-1和TNF-α含量增加，但給藥期和停藥后15 d大鼠與空白對照組相比脾臟均未見異常，表明AA-Ⅰ雖然誘發了炎性反應，但脾臟并不是AA-Ⅰ的靶器官。因此，AA-Ⅰ主要歸肺、肝、腎、心經，用量過大，可造成肺臟、肝臟、腎臟和心臟產生一定的損傷。本研究在肝臟、腎臟及肺臟中均檢測到了AL-Ⅰ，特別是在肝臟和腎臟中多次檢測到了AL-Ⅰ，表明AA-Ⅰ在大鼠體內轉化成AL-Ⅰ，推測肝臟或腎臟可能是AA-Ⅰ轉化AL-Ⅰ的主要場所。研究報道，AA-Ⅰ在肝臟或腎臟中可發生DNA加成，這是AA-Ⅰ引起肝臟和腎臟發生癌變的主要原因[37]。因此，探究AA-Ⅰ的作用靶點、AL-Ⅰ生物轉化部位與轉化條件，以及AL-Ⅰ與DNA加成的作用靶點，將是未來AA-Ⅰ毒性研究的重點與難點，對馬兜鈴酸類中藥在畜禽中的用藥安全具有重要意義。

4 結 論

給大鼠連續7 d灌服20 mg/kg AA-Ⅰ，在五臟中均可檢測到不同含量的AA-Ⅰ，且在肝臟、腎臟、肺臟、脾臟中可檢測到AL-Ⅰ；口服AA-Ⅰ可能對大鼠五臟造成不同程度的損傷，其損傷與AA-Ⅰ誘發的氧化應激相關。