添加高溫期堆料對青藏高原羊糞堆肥有機成分降解及酶活性的影響

蔡 瑞，張 帥，崔欣雨，徐春城

(中國農業大學工學院，北京 100083)

近些年，隨著青藏高原地區畜牧業集約化發展的不斷推進，規模化牧場數量快速增加，產生和積累了大量的畜禽廢棄物。特別是在冬季集中圈養情況下，這些畜禽廢棄物如果不及時處理，會嚴重污染土壤、地下水及空氣等自然環境，破壞牧場周邊地區的生態環境，并威脅人和動物的健康[1]。好氧堆肥是將畜禽糞便轉化為優質有機肥料的有效途徑，是實現畜禽糞便無害化和資源化利用的重要方式[2]。然而，青藏地區高寒、氧氣稀薄以及空氣干燥等特殊氣候條件會造成該地區堆肥發酵緩慢，甚至無法進行，因此全年適合大規模堆肥的時間十分有限，在有限的時間內將大量的畜禽糞便變成高質量的有機肥對該地區化肥農藥減量增效行動、農牧業綠色發展和生態文明建設具有重大意義。

為加快堆肥的腐熟進程、改善堆肥產品質量，使用微生物添加劑是一種較好的方法，其中人工篩選搭配的微生物腐熟劑已廣泛應用于各種原料的堆肥中[3]。然而，研制一套高效的微生物腐熟劑往往需要花費大量的人力和時間，使用商用微生物腐熟劑則需要增加成本。堆料中富含各種微生物，其本身可被看作天然的微生物腐熟劑，并且這種天然的微生物腐熟劑恰好適應相應的堆肥原料，其作用效果可能優于人工分離的微生物添加劑。并且將堆肥過程中的堆料混合于新鮮原料中有利于堆肥的連續化生產，對堆肥產業化發展具有積極正面的影響。目前，將成熟堆肥物料作為添加劑應用于堆肥生產的研究報道較多[4-8]，這些報道主要集中于研究成熟堆料對堆肥腐熟及堆肥過程中溫室氣體減排的作用效果。而利用高溫期堆料作為添加劑的研究鮮有報道，因此有必要進行研究。

本研究將溫室內桶裝發酵的高溫期羊糞堆料添加于在室外(有頂)發酵場進行的羊糞與油菜秸稈混合而成的條垛式堆肥中，通過測定堆肥過程中溫度、碳氮比、種子發芽指數等指標以及堆肥過程中多種酶的活性，研究高溫期堆料對青藏高原羊糞堆肥發酵品質及酶活性的影響，以期為該地區畜禽糞便堆肥化高效利用和連續化生產提供理論依據和生產工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

高溫期堆料取自溫室內桶裝發酵第5天的高溫羊糞堆料(溫度為58 ℃左右)，該堆肥物料是將羊糞和油菜秸稈以4∶1(干重)比例混合發酵而成。供試羊糞為藏系綿羊糞，于2020年7月30日取自青海省巴卡臺農牧場同一羊舍(青海省海南藏族自治州共和縣巴卡臺農牧場，海拔3 300 m左右)，用塑料鏟取羊舍表層羊糞并混合均勻，并經過春季自然干燥。油菜秸稈取自于巴卡臺農牧場農田，風干后粉碎至1 cm作堆肥調理劑。高溫期堆料、供試羊糞和油菜秸稈理化性質見表1。

1.2 堆肥制備及樣品采集

堆肥試驗于2020年8月1日—2020年8月28日在青海省巴卡臺農牧場進行，試驗堆體采用長、寬、高為2 m×1 m×0.6 m的條垛式。本次羊糞堆肥試驗原料以羊糞和油菜秸稈4∶1比例混合而成，堆體初始含水率為60%。試驗共設置2個處理組，分別為添加20%高溫堆料的處理組(DL)和不添加高溫堆料的對照組(CK)。試驗每個處理組設置3個平行，分別于第3、7、10、14、21、28天進行人工翻堆取樣(第0和1天不翻堆，取樣)，在第3、7、10、14、21天取樣后，對堆體進行補水，使其含水率在60%左右。將樣品分為2份，一份鮮樣于4 ℃保存，另一份風干研磨過1 mm篩后備用。

1.3 指標測定及數據處理

每天上午9：00、下午16：00測量堆體溫度，將溫度計均勻插入堆體上、中、下層各3個地點，計算9個點的平均溫度；使用鼓風干燥機(DHG-9123A型)在105 ℃下烘干樣品至恒重，根據烘干前后質量差計算堆肥含水率；總有機碳(TOC)采用重鉻酸鉀容量法測定[9]；總氮(TN)采用凱氏定氮法測定(KDY-9830型凱氏定氮儀)；銨態氮(NH4+-N)和硝態氮(NO3--N)含量使用流動分析儀測定(Seal-AA3型連續流動分析儀)；將新鮮堆肥樣品用去離子水以固液比為1∶10浸提3 h后過濾，分別用pH計(瑞士梅特勒-托利多S20型)和電導率儀(雷磁DDB-303A型)測定pH和電導率(EC)；將堆肥浸提液分別在465和665 nm波長下測定吸光度值(Gold S54T型紫外-可見分光光度計)，兩吸光度的比值為E4/E6[10]；取堆肥浸提液20 mL于9 cm的培養皿中，并墊上濾紙，向浸提液中添加20顆小白菜種子，于20 ℃的黑暗條件下培養48 h后測定種子發芽率和根長，參考Arias等[11]公式計算種子發芽指數(GI)：

堆肥有機質含量采用550 ℃灼燒法測定；木質纖維素的測定采用范式洗滌法[12-13](ANKOM 2000i全自動分析儀)；有機質、半纖維素、纖維素和木質素降解率參考Liu等[14]和Kulikowska等[15]公式計算：

其中，X1為原料灰分含量(%)；X2為樣品灰分含量；OL2分別為樣品中有機質、半纖維素、纖維素、木質素含量；OL1為原料中有機質、半纖維素、纖維素、木質素含量。

堆肥蛋白酶活性測定采用茚三酮比色法測定；酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；糖酶和纖維素酶活性均采用3，5-二硝基水楊酸法測定；葡萄糖苷酶活性采用硝基酚比色法測定；過氧化物酶和多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測定。

1.4 數據統計分析

利用SPSS 23.0軟件進行數據處理，數據以平均值±標準差表示，并對每個取樣點的試驗數據進行獨立樣本t檢驗，利用Origin 2021b軟件進行作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 堆肥過程中溫度、含水率、pH及EC的變化

由圖1A可知，兩個處理組堆肥初始溫度均為13 ℃，隨后堆體溫度迅速上升，DL和CK組在第1天的堆體溫度分別上升至54.4和42 ℃。兩組堆體溫度均在第2天達最高值，分別為62.6和57.5℃。DL組在堆肥前10 d的堆體溫度均超過50 ℃，而CK組堆體溫度超過50 ℃的天數僅為4 d。堆肥15 d后，兩組堆體的溫度均低于30 ℃，并持續下降至20 ℃以下。

由圖1B可知，兩個處理組堆體含水率呈現波動趨勢。堆肥第3和7天，DL和CK組堆體含水率分別下降至51.5%、53.3%和47.6%、50.9%，隨后通過補水，兩個處理組堆體含水率恢復到60%。堆肥結束時，DL和CK組堆體含水率分別為48.3%和46.4%。

由圖1C可知，堆肥初期，兩組樣品pH均上升，堆肥第3～10天，兩組堆體的pH均呈下降趨勢。堆肥第10天至堆肥結束，兩組堆肥pH逐漸上升并趨于穩定。由圖1D所示，堆肥初期，兩組樣品EC值均快速上升，其中DL組于第3天上升至最大值(2.52 mS/cm)，CK組于第5天上升至最大值(2.49 mS/cm)。隨后，兩組樣品EC值均下降，并于堆肥后期逐漸穩定。

同一時間不同組間比較，肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 堆肥過程碳氮及腐熟指標的變化

由圖2A可知，兩個處理組堆體的TOC含量在整個堆肥過程中持續下降。堆肥結束時，DL和CK組的TOC含量分別為34.9%和37.4%，差異顯著(P<0.05)。兩個處理組樣品在整個堆肥過程的TN含量均呈上升趨勢(圖2B)，堆肥結束時，DL和CK組的TN含量分別為2.82%和2.59%，差異顯著(P<0.05)。由圖2C可知，在堆肥前期，兩處理的C/N迅速降低，14天后，所有處理的C/N下降緩慢并逐漸趨于穩定。堆肥結束時，DL和CK組C/N分別為12.4和14.4，差異顯著(P<0.05)。

由圖2D可知，兩個處理組堆體的NH4+-N含量變化趨勢均是先增加后減少；DL和CK組的NH4+-N含量均在第10天達到最高值，分別為4 132和3 743 mg/kg，差異顯著(P<0.05)；堆肥結束時，DL和CK組的NH4+-N含量分別為1 013和1 423 mg/kg，差異顯著(P<0.05)。由圖2E可知，兩個處理組NO3--N含量在堆肥前14 d均增加較少，而在堆肥第14～28天迅速增加，堆肥結束時，DL和CK組的NO3--N含量分別為2 943和2 623 mg/kg，差異顯著(P<0.05)。由圖2F可知，兩個處理組NH4+-N/NO3--N值在整個堆肥過程均呈現下降趨勢，堆肥結束時，DL和CK組的NH4+-N/NO3--N分別為0.34和0.54，差異顯著(P<0.05)。

由圖2G可知，兩組堆肥GI值在前期均呈下降趨勢，并于第3天達到最低值，均低于45%。隨后，均迅速增加，堆肥結束時，DL組的GI值為103.1%，比CK組(90.4%)提高了14%，差異顯著(P<0.05)。由圖2H可知，DL組在堆肥5～21 d的E4/E6值維持在2.6左右，隨后快速上升，于堆肥結束時達到2.82；而CK組E4/E6值于21 d時為2.89，堆肥結束時達到3.07，說明添加高溫堆料可顯著降低堆肥產品E4/E6值(P<0.05)。

圖2 堆肥過程碳氮及腐熟指標的變化

2.3 堆肥過程中有機成分及其降解率的變化

堆肥過程有機質含量及其降解率見圖3A和3B，兩個處理組堆體有機質含量均在堆肥前10 d迅速下降。堆肥第10天，DL和CK組有機質降解率分別為39.9%和31.6%，差異顯著(P<0.05)。隨后兩組樣品有機質降解速度均減慢并最終趨于穩定，堆肥結束時，DL和CK組有機質降解率分別為45.9%和39.3%，差異顯著(P<0.05)。

半纖維素、纖維素和木質素的含量和降解率的變化見圖3C～3H，在整個堆肥過程中，兩個處理組堆肥中半纖維素和纖維素的含量均呈下降趨勢，而木質素含量呈上升趨勢。堆肥前期，兩組堆肥半纖維素、纖維素和木質素均快速降解。在堆肥10 d后，DL和CK組堆肥中半纖維素、纖維素和木質素的降解率分別達35.4%和26.8%、46.2%和36.4%、13.3%和10.8%。隨后半纖維素-纖維素和木質素的降解速度均逐漸減慢，堆肥結束時，DL和CK組的半纖維素、纖維素和木質素降解率分別為40.6%和35.0%、58.7%和50.7%、15.9%和14.8%，均呈現出顯著差異(P<0.05)。

圖3 堆肥過程中有機成分及其降解率的變化

2.4 堆肥過程中酶活性的變化

兩個處理組堆肥過程中酶活性的變化見圖4，兩個處理組蛋白酶活性在堆肥第1天達到整個過程的最高值，隨后兩個處理組堆肥蛋白酶活性下降并維持穩定(圖4A)。兩個處理組脲酶活性在堆肥初期較低，隨后逐漸升高，于堆肥第14天達到最高，在第21天再次降低。DL組脲酶活性除在堆肥第1和28天低于CK組外，其余階段均顯著高于CK組(P<0.05)(圖4B)。兩個處理組堆肥第1天蔗糖酶活性高于第0天，隨后在堆肥前期逐漸降低，并于后期逐漸升高(圖4C)。兩個處理組堆肥纖維素酶在1～3 d活性較高，隨后活性降低并逐漸穩定(圖4D)。整個堆肥過程，DL組纖維素酶活性均顯著高于CK組(P<0.05)。兩組β-葡萄糖苷酶在堆肥第1～5天活性均較高，并且逐漸上升，隨后活性降低并逐漸穩定，DL組β-葡萄糖苷酶活性在堆肥前14 d顯著高于CK組(P<0.05)，在后期低于CK組(圖4E)。兩個處理組過氧化物酶活性均先緩慢增加，并在堆肥第14天達到最高，隨后逐漸降低，DL組過氧化物酶活性在堆肥整個過程均顯著高于CK組(P<0.05)(圖4F)。兩個處理組多酚氧化酶活性在堆肥初期較低，隨后活性逐漸升高，DL組在堆肥發酵前21 d均顯著高于CK組(P<0.05)，在堆肥第28天與CK組差異不顯著(P>0.05)(圖4G)。

圖4 堆肥過程中酶活性的變化

3 討 論

3.1 堆肥過程中溫度、含水率、pH及EC的變化

溫度是反映堆肥中有機物降解和微生物活性的最關鍵指標之一。堆肥過程中的高溫可以殺死沙門氏菌、大腸桿菌和蛔蟲卵等病原微生物，是實現堆肥無害化的重要保障。堆肥初期，由于堆體中大量易降解有機物質的降解，導致兩個處理組堆體溫度迅速上升，并很快進入堆肥高溫期(>50 ℃)。DL組升溫速度、最高溫以及高溫期均優于CK組。這表明在堆肥前期，添加高溫期堆料有利于堆肥升溫，提高堆體最高溫度并延長高溫期。這與高溫堆料中富含Bacillus、Planifilum、Thermobifida和Thermobacillus等耐高溫且具有木質纖維素等有機質降解能力的微生物有關[16-18]。DL組持續的高溫期符合畜禽糞便無害化衛生要求[19]，而CK組不符合。

兩個處理組在堆肥前期的含水率均快速下降，這與前期堆體溫度較高和青藏高原干燥的氣候密切相關。隨著堆體溫度下降，兩個處理組堆肥含水率下降速率減緩。DL組含水率在發酵前期的下降速率快于CK組，這主要是DL組發酵升溫速度快，堆體溫度更高，導致其水分蒸發速率快于CK組。通過定期的補水，可保證兩個處理組堆肥正常發酵，并最終腐熟。

堆肥初期，兩個處理組樣品pH均上升，這可能與堆肥初期有機氮在氨化作用下產生大量的NH4+-N有關[4]。隨后，由于大量低分子有機酸和CO2的產生，兩個處理組堆肥pH均呈下降趨勢[20]。堆肥后期pH逐漸上升，這是由小分子有機酸的降解和氨氣的釋放導致的[4]。

EC值可反映堆肥浸提液的離子總濃度大小，即可溶性鹽的含量，其主要由有機酸鹽類和無機鹽組成,而堆肥中該成分對作物具有毒害作用[21]。一般認為，農用堆肥的EC值不超過3.5 mS/cm時，其對作物的危害作用較小[22]。堆肥前期EC值的上升主要是由于微生物降解有機質產生了大量無機鹽和小分子有機酸，堆肥中后期，氨氣揮發、各種鹽離子沉淀以及小分子有機酸的降解導致堆體的EC值下降[23]。堆肥結束時，兩個處理組樣品的EC值均低于3.5 mS/cm，且添加高溫期堆料可降低堆肥產品EC值。

3.2 堆肥過程碳氮及腐熟指標的變化

兩個處理組TOC含量變化與有機質含量變化類似，這是由于含碳有機物是羊糞堆肥有機質的主要組成部分。兩組樣品在整個堆肥過程的TN含量均呈上升趨勢，這是因為堆肥中含碳有機物質的持續快速降解，由于“濃縮效應”造成TN含量相對升高[24]，這種效應掩蓋了堆肥過程中含氮氣體(NH3和NOX等)的釋放造成的氮素損失。堆肥結束時，DL組TN含量高于CK組，表明添加高溫期堆料可提高羊糞堆肥產品的TN含量。C/N是堆肥過程中的關鍵指標，可以用來作為評估堆肥成熟度的指標[25]。堆肥前期C/N迅速下降，這個結果可歸因于有機碳的降解速度快于有機氮[4]。堆肥結束時，DL組TN含量高于CK組，這表明添加高溫期堆料可顯著降低堆肥產品C/N，促進堆肥腐熟。

NH4+-N和NO3--N是堆肥氮素的重要組成部分。堆肥初期，堆體中含氮有機質大量降解，導致NH4+-N含量迅速增加[26]。隨著堆肥進行，堆體中微生物的同化作用、硝化作用以及NH3的大量揮發，導致堆體中NH4+-N含量逐漸減少[27]。堆肥初期，堆體溫度較高，抑制了硝化菌的活性，導致NO3--N含量較低。而在堆肥中后期，由于堆體溫度下降，促進了堆體的硝化作用，使得大量NH4+-N轉化為NO3--N，并使NO3--N含量迅速上升[28]。硝化作用有利于堆肥的保氮，可使堆肥含有更多可利用的氮素[29]。添加復合菌劑硝化指數(NI)是指NH4+-N 與NO3--N含量的比值，常用于評估堆肥的成熟度，其值越低，表明堆肥產品腐熟度越高。本研究結果表明，添加高溫堆料可促進堆肥中后期NO3--N含量增加和羊糞堆肥腐熟。

GI通常被用來評估堆肥產品的毒性和成熟度，是最重要的堆肥品質指標之一[30]。堆肥初期GI值呈下降趨勢，這是由于堆肥初期堆肥有機質快速降解，產生大量的短鏈脂肪酸、苯酚以及氨氣等物質，這些物質對植物種子具有嚴重的毒害作用[31]，相同的結果也出現在之前的一些研究中[32-33]。隨著有毒物質的快速降解，兩個處理組堆肥GI值均迅速增加。根據之前的研究表明，堆肥GI值>80%即可表明堆肥完全成熟[12,34]，依據這個標準，本試驗的兩個處理組堆肥最終均達到腐熟標準，且添加高溫期堆料可提升堆肥的成熟度。E4/E6是評價堆肥腐熟度的腐殖化參數之一，其值越小，表明堆肥腐殖化程度越大。本研究結果表明，添加高溫期堆料可促進堆肥腐殖化程度。綜合上述腐熟指標的變化表明，添加高溫期堆料可顯著縮短青藏高原羊糞堆肥腐熟時間，減少堆肥生產周期，進而增加單位時間內的羊糞堆肥生產量，這對該地區羊糞廢棄物的減量化和資源化利用具有極其重要的意義。

3.3 堆肥過程有機成分及其降解率的變化

兩個處理組堆肥有機質在堆肥前期均快速降解，這部分有機質主要為易降解的糖類、蛋白質等有機質。隨著易降解有機質快速降解，堆體中有機質主要由穩定的腐殖類物質組成，堆肥物料降解受到限制。高溫堆料中富含木質纖維素等有機質降解菌株，可促進堆肥有機質降解。木質素通常與纖維素、半纖維素相互連接形成具有抗生物降解能力的復雜化合物，被認為是堆肥過程中降解最困難的部分。本次堆肥試驗中，木質素降解率低于半纖維素和纖維素，并且其相對含量在堆肥過程中持續上升，這與之前的一些研究報道相似[14,35]。在本次試驗中，CK組木質素含量及其降解率在整個堆肥過程中均低于DL組，表明添加高溫期堆料可促進木質纖維素的降解，這與高溫期堆料中富含木質纖維素降解菌密切相關。

3.4 堆肥過程中酶活性的變化

堆肥原料富含易利用的糖類、蛋白質、脂肪以及難降解的木質纖維素等有機物質，生物可降解性較強。堆肥中微生物分泌的胞外酶是促進堆肥無害化、減量化及資源化必不可少的活性物質，不僅能催化降解堆肥物料中各種有機質，還在腐殖質的合成以及污染物毒性的削減等過程中發揮著極其重要的作用，有效控制酶作用對實現有機廢棄物資源化利用具有重要意義[36]。蛋白酶在堆肥第1天活性最高，這催化著堆體中蛋白質在堆肥初期快速降解。脲酶的作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產物是氨和碳酸。脲酶活性與物料的微生物數量、全氮和速效磷含量等密切相關[37]。蔗糖酶(轉化酶)可特異性催化非還原糖中β-D-呋喃果糖苷鍵的水解，可催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，為微生物代謝提供直接能量[38]。堆肥中過氧化物酶能氧化堆體中有機質，是堆肥微生物生命活動的結果，在腐殖質的形成過程中起著重要的作用。多酚氧化酶對堆肥中芳香族化合物的轉化起著重要的作用，可催化酚類物質氧化成醌，其活性的變化反映堆肥腐殖化程度與速度，可在一定程度了解堆肥的腐殖化進程[39]。整體而言，添加高溫期堆肥可以提高堆肥中多種酶活性，特別是在堆肥的快速發酵階段。添加高溫期堆料可通過提高堆肥中關鍵酶活性，促進堆肥中木質纖維素等有機物質的降解，進而促進堆肥腐熟，縮減堆肥發酵時間。

4 結 論

添加高溫期堆料可促進堆體升溫，延長堆體高溫期，提升堆肥GI值，并可縮短堆肥腐熟所需時間。添加高溫期堆料可促進堆肥有機物質和木質纖維素降解，并可提升堆肥過程中蛋白質酶、脲酶、蔗糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶及多酚氧化酶活性。