基于免疫途徑的視神經(jīng)炎模型的建立及其發(fā)病機制的探討

郭洪亮，沈笑然

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院，北京100010；2.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京100020)

視神經(jīng)炎是一種自身免疫性脫髓鞘疾病，在短時間內(nèi)反復出現(xiàn)，導致視力下降甚至失明。該病病情進展迅速，多數(shù)患者為單相病程，少數(shù)病人可有緩解-復發(fā)，病程可長達10余年，有致殘率高、易復發(fā)、預后差等特點，嚴重威脅人類的健康。本研究通過構(gòu)建視神經(jīng)炎的動物模型，并在此基礎上進行視神經(jīng)炎致病機制和可干預性治療靶點的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

外源性IL-17單克隆抗體(美國thermo)。EP-1000 Pro型眼電生理檢查儀(德國多美視覺電生理系統(tǒng))。6-8 周齡雌性 C57BL/6 小鼠(體重 18-22 g)20只，由首都醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 方法

1.2.1補體的提取 正常志愿者的血清中人體補體(hc)的制備：獲取3名正常人血液后(經(jīng)本院倫理委員會批準，與本人簽署知情同意)，在室溫下保存30 min后讓血液凝結(jié)成血塊，然后將此標本置于離心管中1 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得到補體混合液，并貯存于-80℃中備用。

1.2.2間接免疫熒光法與直接免疫熒光法檢測AQP4-Ab 間接免疫熒光法的 AQP4-Ab 檢測方法：應用 Lennon 等[1]的方法進行 AQP4-Ab的檢測；直接免疫熒光法檢測AQP4-Ab 抗體:參照 Matsuoka等[2]的方法檢測血清中 AQP4-Ab。二者均陽性病人的血清方可為本實驗備用。

1.2.3視神經(jīng)炎動物模型的制備 隨機分為模型組和對照組各10只實驗小鼠。對照組采用PBS 液行側(cè)腦室注射，視神經(jīng)炎組采用人體補體(hc)及水通道蛋白4抗體(AQP-4-Ab)側(cè)腦室注射[3](該實驗經(jīng)本院動物福利與倫理委員會批準)。采用10份視神經(jīng)脊髓炎患者(經(jīng)本院倫理委員會批準，患者并監(jiān)護人知情同意)血清經(jīng)直接和間接免疫熒光法檢測存在AQP-4 Ab陽性(見圖1A-H)，每份取5 ml，置于促凝管內(nèi)，當天待血液凝固后 2000-3000 r/min離心10 min后分離上層血清，上述血清被PBS稀釋后，裝載到蛋白A親和層析柱上，然后沖洗、洗脫、中和，收集陽性部分，并進行透析、濃縮，再解離并保存在4℃冰箱中待用，其抗體部分含量為7.6-16.6 mg/ml。側(cè)腦室注射體積是5 μl(其中3 μl抗體：2 μl補體)，免疫后第1、3、5、7天給予1次IL-17 0.1 mg腹腔內(nèi)注射強化免疫，連續(xù)4次；對照組應用PBS液5 μl，無腹腔內(nèi)藥物強化。

圖1 直接間接免疫法檢測AQP4抗體陽性血清

1.2.4視神經(jīng)閃光-視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢查 參考FOX等的方法進行改良[4]，使用EP-1000 Pro型眼電生理檢查儀，將小鼠置于室溫恒定的20℃，無光、無聲的暗室中30 min，麻醉后，并將小鼠置木板上固定。采用全視野持續(xù)閃光，刺激強度2cd/m2/s，刺激頻率2.0 Hz，持續(xù)照射5 min。以電極鋼針刺入皮下，記錄電極、參考電極、接地電極分別置于小鼠枕部取兩耳連線中點、小鼠額部、鼠尾等處。檢測一眼時，將另一只眼完全遮蓋。振幅、潛伏期分別以微伏(μV)、毫秒(ms)為單位，觀察并記錄波形。

1.3 視神經(jīng)炎的癥狀評估采用以下標準

視神經(jīng)炎評定：出現(xiàn)眼瞼紅腫或流淚記1分；出現(xiàn)單眼、雙眼部分眼球萎縮或者部分失明記2分；出現(xiàn)單眼、雙眼完全眼球萎縮或者失明記3分。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 行為學評價

對照組(10只)小鼠體重至免疫后兩周平均增長(4.2±1.9) g。模型組小鼠(10只)發(fā)病，表現(xiàn)為體重下降,至發(fā)病時體重平均下降(7.9±2.6) g，發(fā)病后模型小鼠表現(xiàn)為活動少，進食少，皮毛不光滑。

2.2 視神經(jīng)炎評定

10只模型鼠出現(xiàn)眼瞼紅腫和流淚5只；出現(xiàn)視力障礙3只，單眼或雙眼盲2只。從視神經(jīng)炎的評分分析看模型鼠35 d、45 d 與25 d比較，分值明顯升高，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 模型鼠不同時間視神經(jīng)功能缺損評分

其中A：可見大鼠腦組織中可見室管膜周邊有熒光免疫物沉積；圖B：可見血管周圍見熒光免疫標記物質(zhì)沉積。圖C：光鏡下培養(yǎng)的HEK-293細胞形態(tài)：該細胞為轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達的AQP-4的人體胚胎腎細胞-293；圖D ：在波長為488 nm藍色激發(fā)光下，可見在細胞膜發(fā)出綠色熒光，說明該病人血清中含有與抗原結(jié)合的AQP-4抗體，AQP-4抗體為陽性NMO病人，證明AQP-4在細胞膜上表達；E：在波長為405 nm的紫色激發(fā)光下，PI與細胞核結(jié)合，呈現(xiàn)藍色熒光；F：是D和E的融合圖；G：陰性對照組中的光鏡下培養(yǎng)的并穩(wěn)定表達的AQP-4的HEK-293細胞形態(tài)：H：在波長為488 nm藍色激發(fā)光下，未見細胞膜發(fā)出的綠色熒光，說明該病人血清中未含有與抗原結(jié)合的AQP-4抗體。

2.3 視神經(jīng)閃光-視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢查的結(jié)果

2.3.1模型鼠與對照組(右眼)小鼠35天F-VEP檢測 對照組(右眼)小鼠第35天進行F-VEP動態(tài)檢測，結(jié)果呈現(xiàn)較為典型的ST表現(xiàn)(見圖2 K)，S1：(36.17±3.24) ms，T：(58.06±3.03)ms;模型組小鼠于側(cè)腦室注射免疫劑后第35天結(jié)果見圖2 L，S1：(46.07±4.71) ms，T：(69.44±7.70) ms。模型組與對照組比較S1和T波潛伏期明顯延長，兩組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3,表2。

圖2 第35天模型小鼠與對照組小鼠右眼F-VEP比較

表2 正常對照組與實驗模型組第35、第46天(右眼)的相關數(shù)據(jù)比較

2.3.2模型鼠與對照組(右眼)小鼠46天F-VEP檢測 對照組(右眼)小鼠第46天進行F-VEP動態(tài)檢測，結(jié)果見圖4 M，S1：(35.31±3.14) ms，T：(58.16±3.24) ms;模型組(右眼)小鼠于側(cè)腦室注射免疫劑后第46天結(jié)果見圖4 N，S1：(48.10±6.25) ms，T：(73.18±8.44) ms。模型組與對照組右眼在S1和T波潛伏期明顯延長，兩組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5,表2。

圖3 第35天模型小鼠與對照組小鼠右眼F-VEP比較柱狀圖

圖4 第46天模型小鼠與對照組小鼠右眼F-VEP比較

圖5 第46天模型小鼠與對照組小鼠右眼F-VEP比較柱狀圖

2.3.3模型組小鼠與對照組(左眼)小鼠35天F-VEP檢測 對照組(左眼)小鼠第35天進行F-VEP動態(tài)檢測，結(jié)果見圖6P，S1：(37.12±3.46) ms，T：(58.68±1.80) ms;模型組(左眼)小鼠于側(cè)腦室注射免疫劑后第35天結(jié)果見圖6Q，S1：(47.17±3.74) ms，T：(70.09±7.25) ms。模型組與對照組在S1和T波潛伏期明顯延長，兩組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7，表3。

圖6 第35天模型小鼠與對照組小鼠左眼F-VEP比較

圖7 第35天模型小鼠與對照組小鼠左眼F-VEP比較柱狀圖

表3 正常對照組與實驗模型組第35、第46天(左眼)的相關數(shù)據(jù)比較

2.3.4模型鼠與對照組小鼠46天F-VEP檢測 對照組(左眼)小鼠第46天進行F-VEP動態(tài)檢測結(jié)果見圖8 R，S1：(39.37±3.88) ms，T：(58.68±1.80) ms；模型組(左眼)小鼠于側(cè)腦室注射免疫劑后第46天結(jié)果見圖8S，S1：(47.16±2.92) ms，T：(71.26±8.25) ms。模型組與對照組在S1和T波潛伏期明顯延長，兩組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖9，表3。

圖8 第46天模型小鼠與對照組小鼠左眼F-VEP比較

圖9 第46天模型小鼠與對照組小鼠左眼F-VEP比較柱狀圖

3 討論

本研究是在神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病的視神經(jīng)脊髓炎(NMO)動物模型基礎上建立的視神經(jīng)炎小鼠模型，既往研究視神經(jīng)脊髓炎的動物模型是在實驗性自發(fā)性腦脊髓炎模型(EAE)基礎上建立的[3-4]，而EAE模型大多數(shù)神經(jīng)炎癥狀缺如，如髓鞘膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)誘導的 C57BL/6模型，也主要發(fā)生于脊髓部位[5]，但是這些動物模型的病理特征主要模擬了多發(fā)性硬化的病變特性，視神經(jīng)炎癥狀不易誘發(fā)，較難接近NMO的病理特征。有研究者[6-7]采用雙重的轉(zhuǎn)基因鼠做的EAE模型非常接近人類的NMO。

通過轉(zhuǎn)基因處理后的TCRMOG鼠和IgHMOG鼠進行雜交,這種鼠帶有MOG抗原表位特異受體，它們30%的B細胞結(jié)合于MOG抗原表位，同時分泌自身抗體。約一半的雜交TCR MOG X IgH MOG鼠自發(fā)的發(fā)展為嚴重的實驗性自身免疫性視神經(jīng)脊髓炎，但制備該模型鼠要求實驗條件較高，周期較長，成功幾率較小，不利于短期、大量的基礎實驗研究。國外有研究[8-9]把IgG-AQP4 和人血清補體一同注射到大鼠腦實質(zhì)內(nèi)可產(chǎn)生接近NMO的動物模型，但按其文獻記載方法制備動物模型時，根據(jù)實驗結(jié)果顯示：采用腦實質(zhì)注射后小鼠死亡較多，在注射后可出現(xiàn)局灶性的視神經(jīng)脊髓炎樣病灶。還有研究顯示[10]：應用MOG35-55與AQP-4抗體共同免疫小鼠時，其模型出現(xiàn)視神經(jīng)癥狀較少，其機制仍在探討中。

基于AQP-4Ab在NMO疾病上的關鍵作用[11-12]，以及補體-抗體依賴的細胞毒作用在NMO發(fā)病機制的研究[13]，本研究改良Samira Saadoun[9]的方法采用側(cè)腦室注射技術，將經(jīng)直接和間接免疫熒光法鑒定為AQP-4 Ab陽性的視神經(jīng)脊髓炎病人收集血清提取水通道蛋白抗體，同時與人體補體混合后共同免疫C57BL/6小鼠，應用IL-17以強化小鼠體內(nèi)的免疫反應，來獲得自身免疫性視神經(jīng)炎鼠模型，在獲得AQP-4 Ab時，為了避免單一檢測方法存在假陽性的可能，本研究使用的所有病人血清需要滿足直接和間接免疫雙熒光法鑒定為陽性，可用于抗體的提取，這是本研究的關鍵技術之一。當獲得癥狀穩(wěn)定的模型小鼠后，本研究通過視神經(jīng)評分以及電生理學方面對脊髓炎和視神經(jīng)炎癥方面分別進行了鑒定。

研究顯示模型組小鼠與對照組比較進食明顯減少，體重下降，毛發(fā)脫失，精神萎靡。本研究觀察發(fā)現(xiàn)模型鼠在臨床表現(xiàn)上十分接近視神經(jīng)炎病人，視神經(jīng)評分上看在35天后癥狀逐漸達到高峰，表現(xiàn)為眼球萎縮，或視力下降，不能找尋食物與水源，眼部紅腫流淚，甚至眼球萎陷，失明，與人類病癥十分接近。

在視覺誘發(fā)電位的檢測中，本研究采用F-VEP檢測方法顯示：模型組與對照組在S1和T波潛伏期明顯延長，具有明顯差異，說明脫髓鞘存在。在NMO的視神經(jīng)損傷方面的臨床診斷中，VEP在視神經(jīng)脫髓鞘病變的檢測中靈敏度較高，能發(fā)現(xiàn)亞臨床病變，具有很高的應用價值[14]。但VEP 檢測容易受許多因素的影響，比如刺激參數(shù)、麻醉深度、電極放置位置、環(huán)境和溫度，同時也可能由于實驗器材的敏感性等。本研究進而采用相同的實驗條件進行檢測，以對照組大鼠 F-VEP 測量值作為正常參考值，并對每只大鼠每只眼睛的F-VEP 進行對比觀察，分別以第35天、46天的實驗鼠與35、46天的對照鼠進行對比，結(jié)果對照組 T 波和S1 波潛伏期的數(shù)據(jù)變異小，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，可作為進一步研究的參考依據(jù)。實驗中10只發(fā)病大鼠病程中均出現(xiàn)主波潛伏期的延長和波形改變。一般認為VEP潛伏期的延遲主要由脫髓鞘病灶引起。故VEP的變化可以很好地反映視神經(jīng)病變。但本研究檢測的F-VEP特異度為不高，可能與樣本量不夠大有關。實驗鼠在第35天時S1、T值逐漸達到高峰，后逐漸恢復，可能與髓鞘再生和修復有關。

綜上，目前經(jīng)行為學和神經(jīng)電生理等方面諸多方法已驗證視神經(jīng)炎模型已建立成功，填補了國內(nèi)在視神經(jīng)炎動物模型方面的空白。