AFP陰性肝癌早期診斷的蛋白分子標志物

舒 宏

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 檢驗科,廣西 南寧530021)

原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見惡性腫瘤之一，因發(fā)病隱匿且進展迅速，超過80%的肝癌患者在確診時已發(fā)展為中、晚期，甚至失去手術(shù)治療的機會。未能在肝癌早期確診并采取有效治療措施，是導致肝癌患者預后較差、病死率高是主要原因[1-2]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療能有效提高肝癌患者生存率，改善患者的生存質(zhì)量。目前，臨床最常用肝癌的血清學標志物是甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)，但其靈敏度和特異度并不令人滿意，大約80%的小肝癌患者血清中的AFP表達為陰性，無法與良性肝病相鑒別[3]。因此，AFP在肝癌的早期篩查中具有明顯的局限性，迫切需要尋找更特異、更敏感的肝癌，尤其是小肝癌早期診斷的血清學標志物。隨著生物學技術(shù)的發(fā)展，新的血清學標志物不斷被發(fā)現(xiàn)，本文就AFP陰性早期肝癌診斷有價值的血清腫瘤標志物分子進行綜述。

1 已在臨床上應用的AFP陰性肝癌標志物

1.1肝癌三聯(lián)檢 肝癌三聯(lián)檢，包括異常凝血酶原(DCP)、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質(zhì)體比率(AFP-L3%)，是最早應用在臨床上的診斷AFP陰性HCC的標志物組合。美國食品藥品管理局于2005年批準AFP-L3作為肝癌預警的血清學標志物，并將AFP-L3/AFP>10%定義為陽性，提高了肝癌早期診斷靈敏度。DCP是在AFP陰性的肝細胞癌患者因維生素K缺乏，引起凝血酶原前體羧化不全，從而大量產(chǎn)生。DCP診斷肝細胞癌的受試工作者特征曲線下面積(AUROC)為0.86[4]。DCP、AFP和AFP-L3%相互補充[5]，聯(lián)合檢測敏感度和特異度分別為83.0%和75.0%，能有效減少AFP陰性肝癌的漏診。

1.2熱休克蛋白90α(HSP90α) HSP90是熱休克蛋白家族的一員，Hsp90α是其中HSP90的一種亞型。Fu等發(fā)現(xiàn)[6]，Hsp90α同肝癌的發(fā)生和惡性程度密切相關(guān)，且臨床診斷的特性和靈敏性高達90%以上，對癌癥分級和預后有重要意義。該標志物已經(jīng)獲得CFDA批準，在臨床推廣應用。

2 新型AFP陰性肝癌標志物

2.1 蛋白分子

2.1.1骨橋蛋白(OPN) OPN是一種能與整合素和CD44受體家族相結(jié)合的分泌性磷蛋白，在腫瘤細胞的黏附、遷移、浸潤和血管新生中起重要作用。一項研究表明[7]，HCC患者血清OPN水平明顯高于良性慢性肝病患者，用于診斷HCC的AUROC為0.87。在另一項研究中也得到了類似的結(jié)果，診斷AFP陰性HCC的AUROC為0.838，敏感性為78.3%，特異性為79.6%[8]。以上結(jié)果表明，OPN對AFP陰性的HCC有良好的敏感性。此外，在HCC患者診斷前兩年內(nèi)，87%的患者血清中OPN的水平均高于臨界值，表明OPN還可用于臨床前腫瘤預測[7]。

2.1.2中期因子(MDK) MDK是一種肝素結(jié)合生長因子，參與腫瘤細胞生長、侵襲和血管生成。Zhu等研究表明[9]，MDK在肝細胞癌組織和血清樣本中均顯升高，在AFP陰性肝癌患者中，MDK對AFP陰性HCC診斷的敏感性高達89.2%。另一項Meta分析結(jié)果也證實[10]，MDK診斷AFP陰性HCC的靈敏度為88.5%，特異性為83.9%，AUROC為0.91。以上研究表明，MDK可作為診斷AFP陰性HCC的新型標志物。

2.1.3Dickkopf1蛋白(DKK1) DKK1是一種調(diào)節(jié)Wnt信號通路的重要分子。在一項大規(guī)模、多中心驗證研究中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組、HBV感染患者和肝硬化患者相比，DKK1在HCC患者血清中表達水平顯著增高，對AFP陰性的HCC診斷的敏感度和特異度分別為70.4%和90.0%，AUROC為0.841。表明DKK1能有效區(qū)分HCC與非惡性慢性肝病，提高AFP陰性HCC的診斷效率[11]。

2.1.4可溶性酪氨酸蛋白激酶受體(sAX1) sAX1是一種細胞表面的跨膜受體，與相應配體結(jié)合后發(fā)生磷酸化，激活下游信號通路，發(fā)揮促進細胞生長、遷移、聚集和轉(zhuǎn)移等生物學功能。Reichl等[12]通過分析來自多中心的237份對照血清樣本和311份AFP陰性HCC血清中sAxl表達水平，發(fā)現(xiàn)HCC患者血清中sAxl的表達水平顯著升高，其診斷AFP陰性HCC患者的AUROC為0.803，敏感性和特異性分別為73%和70.8%。同時，最近的一項研究也證實[13]，sAxl診斷AFP陰性HCC的AUROC為0.898，敏感性為84.6%，特異性為76.3%。這些研究結(jié)果表明，sAxl是AFP陰性HCC的有效診斷生物標志物。

2.1.5醛酮還原酶家族1成員B10(AKR1B10) AKR1B10是一種分泌蛋白，在肝細胞癌(HCC) 中高表達。在一項1244人參與的大規(guī)模多中心研究中發(fā)現(xiàn)，HCC患者的血清AKR1B10水平顯著高于非HCC患者。其診斷AFP陰性HCC的AUROC為0.891,敏感度是71.2%，特異度為92.6%，并且在早期AFP陰性HCC中也有類似的診斷性能(AUROC0.839，敏感性 63.4%，特異性 90.7%)。因此，AKR1B10可作為檢測早期AFP陰性HCC有效血清標志物[14]。

2.2 巖藻糖基化糖蛋白

在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，蛋白的糖基化的改變是普遍存在的，巖藻糖基化改變是聚糖結(jié)構(gòu)變化的重要形式之一，與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫抑制等密切相關(guān)，可以作為腫瘤診斷、治療和預后的標志物[15]。

2.2.1巖藻糖基化的α-1酸性糖蛋白(Fuc-AGP) AGP是一種主要由肝細胞合成的急性期糖蛋白，根據(jù)病理生理條件具有不同的糖類形式，多種巖藻糖基化AGP可作為肝癌的新生物標志物[16]。Liang等[17]發(fā)現(xiàn)AGP的三巖藻糖基化N-聚糖僅存在于HCC患者中，能有效區(qū)分肝硬化與AFP陰性的HCC，診斷AFP陰性的HCC的AUROC為0.709，敏感性為52%，特異性為80%，表明AGP可作為診斷AFP陰性肝癌的潛在標志物。

2.2.2巖藻糖基化的免疫球蛋白G(Fuc-IgG) 免疫球蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，可能參與體液免疫調(diào)節(jié)，免疫球蛋白的蛋白水平和糖基化結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如IgG的FC段。Yi等[18]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)uc-IgG-L3在健康志愿者、HBV攜帶者、肝硬化患者和HCC患者血清中，IgG-L3%逐漸增加，對APF陰性肝癌診斷AUROC為0.795，敏感性為80.5%，特異性為70.0%。表明IgG-L3%可能是HBV相關(guān)性肝癌有價值的潛在診斷和預后標志物。

2.2.3 巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白(Fuc-Hp)本課題組前期發(fā)現(xiàn)，肝硬化和肝癌患者血清Hp-β鏈內(nèi)含有大量的Lewis X識別的巖藻糖結(jié)構(gòu)[19]。Shang等[20-22]運用凝集素磁珠的Fuc-Hp檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)Fuc-Hp含量在AFP陰性HCC血清中顯著升高，AUROC、特異性、靈敏度和準確度分別為0.929，93.3%，80.8%和84.0%，表明Fuc-Hp對AFP陰性肝癌有良好的預測和診斷效能。

2.2.4巖藻糖基化的血清對氧磷酯酶1(Fuc-PON1) Sun等[23]早期利用了識別末端巖藻糖的凝集素串聯(lián)親和層析的方法富集糖蛋白，并用質(zhì)譜鑒定篩選出差異的糖蛋白PON1，發(fā)現(xiàn)Fuc-PON1有望成為診斷早期肝癌的糖組學標記物。Zhang[24-25]采用凝集素ELISA方法證實Fuc-PON1能有效區(qū)分AFP陰性的早期HCC和AFP陰性的肝硬化，AUROC為0.850，診斷AFP陰性的早期HCC的敏感性為90%，特異性為75%，明顯好于70例AFP陽性患者的檢測結(jié)果。以上研究表明，F(xiàn)uc-PON1可作為AFP陰性肝癌的糖標志物。

3 多種標志物分子聯(lián)合檢測

雖然，新的HCC診斷標志物層出不窮，但至今為止，尚未實現(xiàn)單一標志物精準診斷。因此，科學地推進多種標志物聯(lián)合檢測及檢測方法的標準化，是實現(xiàn)HCC的早診斷、早治療的有效途徑。

3.1 GALAD評分有研究表明[26]，GALAD評分系統(tǒng)的5個指標(年齡、性別、AFP-L3、AFP和DCP)有助于早期 HCC篩查和診斷。該模型對診斷AFP陰性肝癌的敏感性為67.5%，特異性超過90%。

3.2 纖維蛋白原與前白蛋白比值(FPR)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶與血小板比值(GPR)組合Huang等人[27]還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PR和GPR水平在AFP陰性HCC的發(fā)展過程中逐漸升高，與腫瘤大小和巴塞羅那臨床肝癌(BCLC)分期呈正相關(guān)，兩者聯(lián)合能夠有效地診斷AFP陰性肝癌，AUROC為0.977。

3.3 七種自身抗體的組合本課題組近期利用蛋白芯片[28]，采用三階段策略識別血清自身抗體特征，經(jīng)過嚴格的測試驗證發(fā)現(xiàn)7個自身抗體分子(CIAPIN1、EGFR、MAS1、SLC44A3、ASAH1、UBL7和ZNF428)，通過建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN)模型確定它們檢測AFP陰性HCC的診斷效能(AUROC值為0.841-0.948)。特別對于BCLC 0/A期的AFP陰性HCC，其AUROC約增加10%。

3.4 巖藻糖基化激肽原(Fuc-KNG)與常規(guī)實驗室檢測指標聯(lián)合Wang等[29]人發(fā)現(xiàn)，與肝硬化患者相比，肝癌患者的巖藻糖基化水平升高，并開發(fā)了一種Doylestown算法的診斷模型，將Fuc-KNG與年齡、性別、血清堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶水平和AFP相結(jié)合，用于預測肝癌發(fā)病率。該模型檢測AFP陰性HCC患者的AUROC為0.970，真陽性率為89%，而AFP的AUROC為0.597，真陽性率為0%，假陽性率為5%，比以前簡單臨床指標的模型具有更好的診斷性能。

4 結(jié)語

FDA批準的大多數(shù)腫瘤標志物大多數(shù)為蛋白或糖蛋白，其位于細胞表面且容易分泌到循環(huán)系統(tǒng)中，異常蛋白及其糖基化與HCC的發(fā)生密切相關(guān)。以上幾種候選生物標志物有可能顯著改善AFP陰性HCC的早期檢測，具有作為疾病診斷生物標志物的巨大潛力。并且多個候選生物標志物的組合模型可能會產(chǎn)生最佳診斷價值。