血栓通脈膠囊對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機(jī)制的研究

趙佳囡，魏雪晨，叢 姝，邵 丹，宋 哲，唐 宏，馬 杰，王 偉*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021；2.通化市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

血管壁損傷時(shí)，循環(huán)中的血小板被募集到損傷部位，組織因子使血液凝固，最終產(chǎn)生凝血酶和纖維蛋白，當(dāng)病理過程超出止血的調(diào)節(jié)機(jī)制時(shí)，過量的凝血酶形成，引發(fā)血栓形成[1]。其中由于動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷而形成的血栓，會(huì)導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈阻塞，引起心絞痛、心肌梗死和腦梗死[2]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于動(dòng)脈血栓的治療多采用西藥為主并輔以中藥的治療方式，其中多以紅花、桃仁、川芎、當(dāng)歸為主[3]，黃芪在治療血栓方面已經(jīng)有了一定的研究，大多集中在靜脈血栓和肺部血栓栓塞方面[4,5]，對(duì)動(dòng)脈血栓的療效和機(jī)制研究報(bào)道還較少。本實(shí)驗(yàn)以黃芪為君藥，輔以地龍、土鱉蟲、水蛭、桃仁、川芎、橘紅、當(dāng)歸、雞血藤等藥材，制備血栓通脈膠囊，并通過建構(gòu)SD大鼠頸總動(dòng)脈血栓模型及PC12、HUVEC細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型，來探究血栓通脈膠囊對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠30只，8周齡，體重165-175 g，采購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。動(dòng)物飼料、飲用水均進(jìn)行消毒處理，室內(nèi)溫濕度恒定。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PC12)采購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)(編號(hào)：KCB93033YJ)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)采購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)(編號(hào)：KCB2012087YJ)。

1.1.3藥物與試劑 血栓通脈膠囊由通化市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供。二磷酸腺苷(上海麥克林生化科技有限公司)；蘇木素伊紅染色試劑盒(北京索萊寶生物科技)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢elabscience)；高糖培養(yǎng)基(康寧公司)；小牛血清(美國(guó)Gibco公司)；3%過氧化氫(美國(guó)Sigma公司)；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Promega公司)；乳酸脫氫酶、微量還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、丙二醛檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù))；ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；PARP抗體(Invitrogen公司)；p-Eif2α、Eif2α、p-IRE1抗體(Affinity公司)；IRE1、GAPDH抗體(Santa Cruz)；cleaved caspase-3抗體(Abcam公司)；三氯化鐵、10%多聚甲醛與其他化學(xué)試劑(北京化工集團(tuán)公司)。

1.1.4儀器 低溫臺(tái)式離心機(jī)(中國(guó)DLAB公司)；體外血栓形成儀(北京普利生儀器有限公司)；血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)；化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(上海天能科技有限公司)；酶標(biāo)儀(THERMO公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后連續(xù)灌胃給藥7天，低劑量組大鼠每日給藥0.2 g/kg，高劑量組大鼠每日給藥0.4 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給復(fù)方丹參片0.26 g/kg，對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水。

1.2.2含藥血清的制備 給藥組大鼠每日給藥量為0.4 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給復(fù)方丹參片0.26 g/kg，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，每日灌胃一次，連續(xù)給藥7天。末次給藥前12 h禁食不禁水。末次給藥2 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3-0.5 g/kg)進(jìn)行麻醉。打開腹腔分離開下腔靜脈與腹主動(dòng)脈，夾閉遠(yuǎn)心端使動(dòng)脈膨起，使用采血針進(jìn)行采血。全血4℃靜置1 h，4℃ 3000 rpm離心10 min，分離血清，并將同組血清合并，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后-20℃保存。

1.2.3FeCl3誘導(dǎo)SD大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成 末次給藥2 h后，用浸有50% FeCl3的濾紙條包裹動(dòng)脈形成頸總動(dòng)脈血栓，稱重動(dòng)脈血管段及血管重量，計(jì)算血栓重量及血栓抑制率。對(duì)照組以生理鹽水替代FeCl3。

血栓抑制率(%)=(對(duì)照組血栓重量-給藥組血栓重量)/對(duì)照組血栓重量×100%

1.2.4體外血栓形成試驗(yàn) 頸總動(dòng)脈血栓造模后，對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，利用體外血栓形成儀形成血栓，烘干后進(jìn)行稱重，并計(jì)算血栓抑制率。

1.2.5抗血小板凝集實(shí)驗(yàn) 頸總動(dòng)脈血栓造模后，對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，離心分離出富血小板血漿(PRP)和分離出的上層血漿即為貧血小板血漿(PPP)，利用血小板聚集儀檢測(cè)血小板最大聚集率，計(jì)算血小板聚集抑制率。

血小板聚集抑制率(%)=(對(duì)照組平均聚集率-給藥組平均聚集率)/對(duì)照組平均聚集率×100%

1.2.6ELISA法檢測(cè) 頸總動(dòng)脈血栓造模后，對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，全血靜置1 h，4℃ 3000 rpm離心10 min，分離血清，對(duì)TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1指標(biāo)用ELISA法檢測(cè)，指標(biāo)檢測(cè)操作均按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.2.7H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷模型 按4×103個(gè)/孔的密度將PC12、HUVEC細(xì)胞鋪進(jìn)96孔板中，正常培養(yǎng)24 h后更換為不同H2O2濃度的完全培養(yǎng)基，處理12 h，CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力。H2O2濃度如下：PC12細(xì)胞為0、200、300、400、500、800 μmol/L；HUVEC細(xì)胞0、600、700、800、900、1000 μmol/L。

1.2.8CCK-8法檢測(cè) 按4×103個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種在96孔板中，分別按照空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行處理，CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力。各組處理如下：總血清濃度為15%，其中低劑量組、中劑量組、高劑量組含藥血清濃度分別為5%、10%和15%，陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性血清含量為10%，其余血清用小牛血清補(bǔ)齊，處理24 h后，采用含H2O2的上述血清濃度的培養(yǎng)基處理12 h，H2O2濃度由上述實(shí)驗(yàn)確定。

1.2.9氧化應(yīng)激指標(biāo) 按1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種在12孔板中，分別按照空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行處理，檢測(cè)PC12、HUVEC細(xì)胞中LDH釋放量和GSH、NO、SOD、MDA、ROS含量，操作均按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.2.10Western Blot檢測(cè) 按2×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種在6孔板中，分別按照空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行處理后，用lysis buffer收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞后離心，對(duì)上清液進(jìn)行BCA蛋白定量，變性5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量為15 μg。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗，洗滌后進(jìn)行ECL顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠頸總動(dòng)脈血栓重量的影響結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，50% FeCl3可造成SD大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成(P<0.01)；與模型組相比，血栓通脈膠囊及復(fù)方丹參片均可顯著抑制血栓形成(P<0.01)。

表1 血栓通脈膠囊對(duì)FeCl3誘導(dǎo)SD大鼠頸總動(dòng)脈血栓重量的影響

2.2 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠體外血栓形成的影響結(jié)果如表2所示，與模型組相比，血栓通脈膠囊及復(fù)方丹參片均可顯著抑制體外血栓形成(P<0.01)，低劑量組和高劑量組效果均超過陽(yáng)性組。

表2 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠體外血栓形成血栓重量的影響

2.3 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠血小板聚集的影響結(jié)果如表3所示，與對(duì)照組相比，模型組血小板聚集率顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，血栓通脈膠囊及復(fù)方丹參片均可顯著抑制血小板聚集(P<0.01)，且隨劑量增加，抑制效果增強(qiáng)，其中高劑量組效果超過陽(yáng)性對(duì)照組。

表3 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠血小板聚集的影響

2.4 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1含量的影響與對(duì)照組相比，血栓模型組SD大鼠血清中6-Keto-PGF1α含量顯著下降、TXB2、ET-1含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，血栓通脈膠囊和復(fù)方丹參片均可顯著下調(diào)大鼠血清中TXB2、ET-1含量，并提高6-Keto-PGF1α含量(P<0.01)，見圖1。

圖1 血栓通脈膠囊對(duì)SD大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1含量的影響

2.5 H2O2誘導(dǎo)PC12、HUVEC細(xì)胞氧化損傷模型濃度的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力隨著H2O2濃度的升高而下降。最終選擇300 μmol/L H2O2作為PC12細(xì)胞的氧化損傷模型的處理濃度(P<0.05)，選擇800 μmol/L H2O2作為HUVEC細(xì)胞的氧化損傷模型的處理濃度(P<0.01)。

圖2 PC12、HUVEC細(xì)胞在不同濃度H2O2處理下細(xì)胞的活力比較

2.6 血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)PC12、HUVEC細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，不同濃度的血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)H2O2處理的細(xì)胞均有保護(hù)作用，除HUVEC細(xì)胞低濃度組外，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)PC12、HUVEC細(xì)胞活力的影響

2.7 血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)PC12、HUVEC細(xì)胞LDH釋放量和GSH、NO、SOD、MDA、ROS含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組的LDH、MDA、ROS指標(biāo)有顯著上調(diào)(P<0.05)，各個(gè)劑量的血栓通脈膠囊含藥血清和陽(yáng)性對(duì)照組均對(duì)H2O2的處理效果有抑制作用，除HUVEC細(xì)胞的LDH低劑量組外，抑制效果均有顯著性差異(P<0.05)；GSH、NO、SOD 3個(gè)指標(biāo)結(jié)果中，與對(duì)照組相比，模型組均有顯著性下調(diào)(P<0.05)，各個(gè)劑量的血栓通脈膠囊含藥血清和陽(yáng)性對(duì)照組均對(duì)H2O2的處理效果有上調(diào)作用，其中陽(yáng)性對(duì)照組在 PC12細(xì)胞中的GSH指標(biāo)、HUVEC細(xì)胞中的SOD指標(biāo)中沒有顯著性效果，HUVEC細(xì)胞的GSH低劑量組也無顯著性效果。

圖4 不同濃度血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)PC12、HUVEC細(xì)胞中LDH釋放量和GSH、NO、SOD、MDA、ROS含量的影響

2.8 血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)PC12、HUVEC細(xì)胞PARP、p-IRE1、IRE1、p-Eif2α、Eif2α、cleaved caspase-3和GAPDH表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，模型組PARP、cleaved caspase-3、p-IRE1 p-Eif2α指標(biāo)均有顯著上調(diào)(P<0.05)，其中在PC12細(xì)胞中，血栓通脈膠囊含藥血清的中劑量組對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷均有顯著性抑制效果(P<0.05)；在HUVEC細(xì)胞中，血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)H2O2有道的氧化損傷有明顯抑制效果，除 cleaved caspase-3外均有顯著差異(P<0.05)。

圖5 不同濃度血栓通脈膠囊含藥血清對(duì)PC12、HUVEC細(xì)胞中PARP、p-IRE1、IRE1、p-Eif2α、Eif2α、 cleaved Caspase-3和GAPDH蛋白指標(biāo)的影響

3 討論

血栓通脈膠囊以黃芪為君藥，黃芪甲苷作為主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫及脂肪代謝等作用[6]，且有研究證明黃芪甲苷可以改善動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血脂和炎癥情況[7]，說明黃芪甲苷極有可能具有抗栓作用。

內(nèi)皮細(xì)胞具有維持毛細(xì)血管通暢及其功能的關(guān)鍵作用，直接參與外周血管疾病、靜脈血栓形成、中風(fēng)、心臟病、糖尿病、慢性腎衰、腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移和嚴(yán)重病毒感染等疾病[8]。動(dòng)脈血栓的形成主要與血小板功能異常、血管內(nèi)膜損傷、凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)發(fā)生病變等因素有關(guān)[9-11]。本實(shí)驗(yàn)選擇以FeCl3處理大鼠頸總動(dòng)脈誘導(dǎo)血栓形成模型來觀察血栓通脈膠囊對(duì)血栓形成的影響及作用機(jī)制，F(xiàn)eCl3在局部浸潤(rùn)動(dòng)脈可使血管內(nèi)膜剝脫，內(nèi)膜下組織暴露，通過Fe3+誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，損傷血管內(nèi)皮，促使血小板黏附、聚集并發(fā)生釋放反應(yīng)，激發(fā)凝血過程，導(dǎo)致血管混合性血栓形成[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血栓通脈膠囊可顯著抑制SD大鼠體內(nèi)及體外血栓形成，同時(shí)可顯著抑制SD大鼠血小板聚集，可顯著提高6-Keto-PGF1α含量，而下調(diào)SD大鼠血清中TXB2、ET-1含量。

促氧化與抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)均存在，在正常生理狀態(tài)下，兩者產(chǎn)生及消除氧自由基處于一種平衡狀態(tài)。體內(nèi)的氧自由基來源十分廣泛，許多物質(zhì)在一定條件下均可生成氧自由基。當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞受到損傷或刺激時(shí)，常常會(huì)導(dǎo)致促氧化物質(zhì)生成增加，抗氧化物質(zhì)減少，進(jìn)而體內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生卻無法及時(shí)清除，導(dǎo)致發(fā)生氧化應(yīng)激[13-14]。

H2O2是機(jī)體自然產(chǎn)生的重要活性氧之一，主要產(chǎn)生于血管壁中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等處，易在體內(nèi)環(huán)境下分解，產(chǎn)生氧自由基等成分，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用，是研究細(xì)胞氧化損傷的首選材料[15]。LDH是一種存在于細(xì)胞漿內(nèi)的酶，在生命體的糖代謝中扮演重要角色。壞死的細(xì)胞胞膜破裂，使LDH被釋放于培養(yǎng)液中，因此檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH的含量可用來表示培養(yǎng)細(xì)胞中壞死細(xì)胞的量[16]。GSH是一種體內(nèi)重要的自由基清除劑和抗氧化劑，它可以把對(duì)機(jī)體有害的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為對(duì)機(jī)體無害的物質(zhì)，排出體外[17]，GSH的量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。NO可作用于血管平滑肌，使其松弛，擴(kuò)張血管，同時(shí)NO還可與血液中的游離氧自由基結(jié)合，降低體內(nèi)自由基數(shù)量[18]。SOD是機(jī)體內(nèi)的一種抗氧化酶，主要負(fù)責(zé)清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基，在生物體內(nèi)的含量多少是反應(yīng)機(jī)體衰老與死亡的直觀指標(biāo)[19]。MDA，是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，一般可以通過測(cè)定MDA含量來反應(yīng)細(xì)胞膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度。以上指標(biāo)及ROS均可反應(yīng)細(xì)胞的氧化程度，故本實(shí)驗(yàn)選擇以上六項(xiàng)作為衡量血栓通脈膠囊含藥血清抗氧化能力的指標(biāo)。

細(xì)胞凋亡時(shí)，多種凋亡相關(guān)因子被激活活化，并進(jìn)一步激活下游因子，最終使底物蛋白分解，細(xì)胞崩解。Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡過程的一種最重要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮不可替代的重要作用。而PARP作為Caspase-3的主要作用底物，是一種用來修飾翻譯后的多功能蛋白質(zhì)的酶，可被損傷的DNA片段所激活，與DNA的損傷密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)等途徑，來調(diào)控細(xì)胞的各種功能，而IRE1通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要通路之一。IRE1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜傳感器，可通過激活未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞的正常功能。雖然哺乳動(dòng)物體內(nèi)的IRE1可促進(jìn)細(xì)胞存活，但它也可以通過抑制凋亡miRNA的衰變來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[20]。

本實(shí)驗(yàn)選擇用H2O2處理HUVEC和PC12細(xì)胞作為考察對(duì)象，分別模擬內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度的血栓通脈膠囊含藥血清均對(duì)H2O2處理的HUVEC和PC12細(xì)胞有保護(hù)作用，且隨著含藥血清濃度的提高，保護(hù)作用顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血栓通脈膠囊含藥血清可顯著降低HUVEC及PC12細(xì)胞的LDH、MDA、ROS含量，并提高GSH、NO、SOD含量，表明血栓通脈膠囊含藥血清可減少細(xì)胞內(nèi)LDH外溢，降低細(xì)胞的膜脂過氧化程度，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量，而GSH、NO、SOD等抗氧化酶含量增高，提示血栓通脈膠囊含藥血清具有一定的保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷的能力。